GSTSefinoseresin样品的制备.doc

样品的制备： * 下面的方案在许多实验室已被证明可行，当然其他的方案也可实行。 1.对于在E.coli表达的蛋白，向每克细胞浆中加入5~10ml结合缓冲液，摇匀，以稀释细胞浆； 2.细胞的酶解：向体系中加入终浓度为0.2mg/ml的溶菌酶，20ug/ml 的DNA酶，1mmol的MgCl2 ，1mmol的PMSF或者其他蛋白酶抑制剂，（但该抑制剂不能与树脂产生任何结合作用）之后于4度下搅拌30分； 3.机械破碎：超声法、反复冻融法等； 4.将溶解后产物的pH调至7.4（勿使用强酸强碱） 5.离心：将产物转移至洁净的离心管中，4°C 以12000转/分 离心20分钟； 6.收集上清液，进行纯化；（注意：样品在和树脂作用前应用0.45um过滤器快速过滤，如果样品粘度太高，应稀释以防止阻滞于柱中） 7.对于要通过酵母菌、昆虫等在培养基中表达的蛋白，如果上清液体积较大，通过硫酸铵将蛋白沉淀，之后以1*PBS进行透析，加入柱中； 纯化步骤： A.通过批量方法对GST标记蛋白纯化： 1.向试管中加入适量的GST Sefinose Resin ，在700*g下离心2分钟，小心移去上清液； 2.加入10倍树脂床体积的清洗液，混匀，直至树脂能完全分散； 3. 在700*g下离心2分钟，小心移去上清液； 4.对于昆虫和哺乳动物细胞溶解物，以5倍体积的洗液与蛋白提取物混合，准备试样； 5.向混匀的树脂中加入大肠杆菌细胞浆的蛋白提取物，或昆虫、哺乳动物细胞溶浆与洗液的混合物，在室温或4°C下上下颠倒混合30~60分钟； 6. 在700*g下离心2分钟，若结果满意，保留上清液作进一步分析； 7. 以5~10倍树脂床体积的清洗液冲洗树脂，在700*g下离心2分钟，小心移去上清液，若结果满意，保留上清液作进一步分析； 8.重复洗脱步骤，通过测定280nm处的吸光度值来监测上清液，直至其到达基线； 9.用1倍树脂体积的洗脱液洗脱GST标记蛋白。在700*g下离心2分钟，小心保留上清液，重复该步骤2次，将每次的上清液置于不同的试管中； 10. 通过测定280nm处的吸光度值来监测蛋白的洗脱情况，洗脱后的蛋白应立即进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳； B, 通过重力流动柱方法对GST标记蛋白纯化： *1ml或5ml柱的加样总体积分别是10ml或30ml，若样品的总体积比柱体积大，多次重复步骤直至全部试样过柱，注意不可超过树脂柱的限定体积 1.多次缓慢颠倒容器混合悬浮液，以使其完全悬浮与树脂中，用移液管移取适量悬浮液加入柱中，使柱中树脂沉淀，贮存液从柱内流出。 2. 对于昆虫和哺乳动物细胞溶解物，以5倍体积的洗液与蛋白提取物混合，准备试样； 3.以10倍柱体积的洗液混匀柱子，使其平衡，以0.5~1ml/分的流速使所有缓冲液流出，直至280nm处吸光度值稳定； 4. 以0.5~1ml/分的流速向混匀的树脂中加入大肠杆菌细胞浆的蛋白提取物，或昆虫、哺乳动物细胞溶浆与洗液的混合物，收集流出液作进一步分析，如果需要，重复以使结合在柱上的液体量达到最大 5. 以5~10倍树脂床体积的清洗液冲洗树脂，收集流出液，用一个新的试管重复此步，直至流出的部分在280nm处的吸光度达到基线，保留流出液，用SDS方法检测其对介质的结合效率； 6. 用2倍树脂体积的洗脱液洗脱GST标记蛋白，重复该步骤2次，将每次洗脱后的液体置于不同的试管中； 7. 通过测定280nm处的吸光度值来监测蛋白的洗脱情况，洗脱后的蛋白可直接进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳； C.GST Sefinose Resin的贮存步骤： *在每次使用前，应按以下步骤操作，以除去残留的谷胱甘肽和非特异性结合蛋白。为防止样品交叉污染，每份样品应分别过柱 1.加入5倍床体积的再生缓冲液1（0.1mol/L Tris + 0.5mol/L NaCl + 0.1% SDS, pH=8.5） 2.加入5倍床体积的超纯水； 3.加入5倍床体积的再生缓冲液2（0.1mol/L NaAc + 0.5mol/L NaCl + 0.1% SDS, pH=4.5） 4. 加入5倍床体积的超纯水; 5.用5ml 0.05%的叠氮化钠清洗柱子，将柱的顶端、底端封口，贮存。 注意：1。流速是影响实验的关键，在样品添加、过柱的时候，一定要缓慢，此外，蛋白的性质，pH，温度等因素也会影响结合能力； 2.对于不同标记蛋白，洗脱的体积、次数会有不同。对于高浓度的谷胱甘肽应增加洗脱次数，从柱中洗脱下来的溶液应用SDS以及Western 印迹检测GST标记蛋白； 3.GST Detection Module 可用于优化洗脱条件，或跟踪GST结合蛋白的纯化； ……. GST结合蛋白的分裂： 在大多数情况下， 1.凝血酶： Mr=37000 凝血酶分离缓