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一个新的具有特殊结构和潜在趋化活性 的人细胞因子趋化素样因子1的克隆和特性研究 韩文玲 娄雅欣 唐军民 张颖妹 陈英玉 马大龙 等 细胞因子是在免疫和炎症反应中起重要作用的小分子蛋白质。近年来，越来越多的细胞因子得以发现。本文介绍一种新的细胞因子趋化素样因子1（CKLF1）的发现和特性研究。CKLF1全长cDNA序列包括530个碱基，有一个编码99个氨基酸的完整开放读码框架。CKLF1与已发现的其它细胞因子没有明显的序列同源性。CKLF1在PHA刺激的U937细胞中的表达可被IL-10所部分抑制。重组的CKLF1能够明显趋化嗜中性细胞、单核细胞和淋巴细胞，同时，它能够刺激小鼠骨骼肌细胞的增殖。以上结果表明CKLF1可能在炎症和骨骼肌再生过程中发挥重要作用。 关键词：白细胞介素10；骨骼肌细胞；剪切；抑制性减数杂交 前 言 细胞因子是一群在免疫和炎症反应中起重要作用的小分子蛋白质。总的来说，细胞因子在细胞被活化后呈一过性诱导表达，其表达受多种因素调控。细胞因子包括白细胞介素、肿瘤坏死因子、生长因子和趋化因子等（1）。其中，趋化因子是结构相似的小分子蛋白质，在吸引和活化白细胞过程中起重要作用。趋化因子在蛋白质水平上含有4个保守的半胱氨酸，根据前两个半胱氨酸的相对位置不同，趋化因子可分为CXC（α）、CC（β）、C（δ）和CX3C（γ）4个亚家族，C代表半胱氨酸，X代表任一氨基酸（2）。 以前的研究表明：人前单核细胞系U937细胞在PHA刺激下，能够产生多种细胞因子；而白细胞介素10能抑制多种细胞因子的产生（3）（4）。基于以上研究结果，我们设计了一条新的技术路线来发现新的细胞因子。利用抑制性减数杂交技术，从PHA刺激的U937细胞中克隆到能被IL-10所抑制的cDNA序列，其中一个序列编码一个新的分泌性细胞因子，含有CC家族趋化因子所具有的特征性结构即两个连续的半胱氨酸，并对多种白细胞具有趋化作用，该因子被命名为趋化素样因子1（CKLF1）。但是，该因子与其它CC家族趋化因子有如下区别：（1）CKLF1成熟蛋白质只有一个连续的CC结构，其羧基端没有其它的半胱氨酸；（2）CKLF1与已发现的其它CC家族趋化因子没有明显序列上的同源性； （3）CKLF1至少存在其它三种不同的RNA剪切形式；（4）它对骨骼肌细胞有刺激作用。CKLF1可能代表一个新的家族的趋化因子。因此，我们将其命名为趋化素样因子1，其相应的变异体命名为CKLF2，CKLF3和CKLF4。 材 料 和 方 法 抑制性减数杂交（SSH） SSH的操作方法按Diatchenko报道的进行操作(5)， 用CLONTECH公司的 PCR-Select TM cDNA Subtraction Kit。SSH技术把抑制性PCR(Suppression PCR)和传统的减数杂交方法相结合(16)，可用于比较两个群体的mRNA，得到在一组mRNA中表达，而在另一组mRNA中低表达或不表达的基因。先将mRNA反转录为cDNA，其中含有特异表达基因的样本为tester，另一组为driver，tester和driver cDNA杂交，去除杂交体cDNA，没有形成杂交体的cDNA即是在tester中特异表达或高表达的基因，而在driver中不表达或低表达的基因。抑制性PCR在选择性扩增特异基因的同时，抑制自身的扩增，使杂交阳性率更高。在SSH操作过程中，人前单核细胞系U937细胞由本室长期传代培养。细胞培养在含10%胎牛血清 ，100U/ml青链霉素的RPMI1640培养基中。用于SSH操作的U937细胞批量培养至2×107细胞，离心收集细胞, 用Hank’s液洗三遍后悬于含10ng/mlPHA的10% FCS RPMI1640中, 其中一半即1×107细胞作为tester, 另一半细胞中加入终浓度为100ng/ml的IL-10作为driver。继续培养8小时后收集细胞， 提取mRNA，取2(gmRNA合成双链cDNA，用RsaI切后，将tester分为两组，在T4 DNA连接酶作用下，分别连上Adapter1和Adapter2，进行两轮杂交，杂交产物用作PCR扩增的模板。将杂交产物稀释1000倍，利用试剂盒提供的PCR引物，进行第一轮PCR，扩增27轮，然后将第一轮PCR产物稀释10倍，分别以NESTED PCR引物1和 NESTED PCR引物2R进行第二轮PCR，扩增15轮，得到的扩增产物即为差异基因片段，Glassmilk回收200－1600bp的片段，克隆到pGEM-T easy中，连接产物转化XL-Blue菌，选白色克隆。得到约100个克隆，随机筛选15个变大明显的克隆，纯化质粒DNA，用ALF快速测序仪进行序列分析，并在NCBI中进行序列同源性比较。 生物信息学 将来自PHA刺激