PCRDGGE操作步骤.doc

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16S rDNA - DGGE技术基本路线一 样品总DNA的提取 1 实验器材: 1.5mL离心管,螺口管,锆珠,搅拌器,4℃离心机。 2 实验试剂: PBS(0.05M, pH=7),水饱和酚,TE饱和酚,TNI50,TE缓冲液,TAE缓冲液,NaAc(pH=5.2),氯仿/异戊醇(24:1)(v/v),96%冷乙醇,70%冷乙醇。 3 实验操作: 3.1 细胞的分解 称取食糜0.3-0.5g,入含0.3g锆珠的离心管中,加1mL TN150溶解 然后加入150μL酸性酚,bead-beater 5000rpm,匀浆180秒,冰上冷却 加入150μL氯仿/异戊醇(24/1),vortex几秒,10000rpm离心5min,上清转移至eppendorf管。 3.2 DNA提取 加入150 μL氯仿/异戊醇至eppendorf管 加入150 μL TE饱和酚,涡旋混匀1 min 10000 rpm离心,1 min 重复上述步骤直至界面清晰为止 加入300 μL氯仿/异戊醇,10000 rpm离心1 min 取上清液至另一eppendorf管,加96%冷乙醇1mL 加入50 μL3M NaAc(pH=5.2) -20℃沉淀DNA过夜 10000 rpm离心20 min 去除上清液,加入500 μL 70%冷乙醇溶解沉淀 10000 rpm离心5 min 去除上清液,风干沉淀 加入50μL TE缓冲液溶解DNA -20℃保存提取的DNA 实验注意事项: 酚是致癌物质,实验操作应配带手套,且不要将该溶液洒在桌面上或地面上。 实验中使用了挥发性有毒物质,操作应在通风橱中进行。 实验过程中样品应放置冰面上,所有离心操作在4℃下进行。 二 DNA的检测 — 琼脂糖凝胶电泳 试剂和器材:电泳缓冲液(1*TAE),溴乙锭(EB)染色贮存液(1 mg/mL), 0.25%溴酚兰,琼脂糖,双蒸水。 电泳仪,水平电泳槽,透射紫外灯,胶带纸。实验操作 2.1 凝胶板的制备: 称取1.2 g琼脂糖置于小锥形瓶中,加入100 mL 1*TAE稀释缓冲液,加热直至琼脂糖完全溶解(透明溶化液)。戴手套操作:小心加入5 μL EB染色贮存液,摇匀。 用胶带纸将洗净、干燥的电泳凝胶床的两端开口封好,形成一个胶模,水平放在工作台的位置上。将梳子插进托盘长边的凹槽内,梳出底边和托盘表面保持0.5-1mm的间隙。 待琼脂糖冷却至65 ℃左右,将温热凝胶倒入胶模中,凝胶的厚度在3-5mm之间。倒胶时要避免产生气泡,若有气泡可用吸管小心吸去。 待凝固完全后,用小滴管在梳出附近加入少量TAE缓冲液润湿凝胶,双手均匀用力轻轻拨出样品槽摸板,则在胶板上形成互相隔开的样品槽。 取下封边的胶带纸,将凝胶连同托盘(凝胶板点样孔靠近负极一端)放入电泳槽平台上,倒入电泳缓冲液直至浸没凝胶面2-3 mm。 2.2 加样: 用微量加样器或可调枪依次将所提取DNA加入加样孔内。 2.3 电泳: 加样完毕,盖上电泳槽,通电5-10 v/cm,恒压电泳,DNA向阳极移动,当染料条带移动到距凝胶前沿约1cm处时,停止电泳。 2.4 观察: 小心取出凝胶置托盘上,推至预先用75%酒精消毒的紫外灯观测台上,在波长250nm紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现桔红色荧光。肉眼可观测到清晰条带,荧光在4-6h后减弱。 实验注意事项: 溴化乙锭(EB)是诱变剂,配置和使用时应带手套,且不要将该溶液洒在桌面上或地面上,凡是被其沾污的地方须经专门处理后才可进行清洗和消毒。 加样多少取决于加样槽大小,加入样品体积应略小于加样槽体积。 观测时避免紫外灯对眼睛的伤害。 正确选择电泳缓冲液,因为缓冲液中缺失离子,DNA全然不动或迁移很慢,高离子强度 则在电泳中会产生大量热量,凝胶融化导致DNA发生变性。本实验选择1*TAE缓冲液。三 16s rDNA片段扩增 1 细菌通用引物: EUB-968Gc for:5ˊ CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA GGG GAA CGC GAA GAA CCTTAC 3ˊ EUB-L1401 rev:5ˊ CGG TGT GTA CAA GAC CC 3ˊ 2 反应体系: 反应液组成: 单个样品量 MQ 37.75 μL dNTP 0.5 μL MgCl2 3 μL PCR缓冲液

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