抗体库技术培训课件.ppt

第十三章 抗体库技术 鲍永华 (baoyonghua2005@126.com) 新乡医学院免疫学教研室 基因工程抗体技术 20世纪80年代, DNA重组技术发展使制备部分或全部人源化的基因工程抗体成为可能，因此产生了基因工程抗体技术。 第一节 抗体库技术 进入20世纪90年代，组合化学技术与基因工程抗体技术相互结合产生了抗体库技术。从此抗体工程技术进入了一个新的发展阶段。 抗体库技术的产生基于两项关键技术的突破：①PCR技术的出现和发展使人们能够使用一套引物扩增出全套免疫球蛋白可变区基因;②利用大肠杆菌成功表达出具有抗原结合功能的抗体分子片段。 概 念 所谓抗体库(antibody library)技术,就是用基因克隆技术克隆全套抗体重链和轻链可变区基因,然后重组到特定的原核表达载体中,再转化大肠杆菌以表达有功能的抗体分子片段,并通过亲和筛选获得特异性抗体可变区基因的技术。 抗体库技术经历了组合抗体库、噬菌体抗体库、核糖体展示(ribosome display)抗体库3个发展阶段。 英国剑桥的Ward等最早尝试了抗体库的构建，他们用PCR从溶菌酶免疫后的小鼠脾细胞DNA扩增出VH基因,测序证实了其多样性,在大肠杆菌表达出VH段(单区抗体),检测2000个克隆得到21个可以与溶菌酶特异结合的克隆。 这一工作未构建完整的抗原结合部位(无轻链),也未提出有效的筛选方法,但它表明了抗体库技术的可行性。 2个月之后，Science上发表了美国Scripps研究所Huse等的完整的抗体库工作,他们用逆转录-PCR技术从淋巴细胞克隆出抗体轻链基因repertoire和重链Fd段基因repertoire,将两者分别组建到噬菌体表达载体中（如下图）。 抗体库技术较细胞融合杂交瘤技术制备单抗有着明显的优越性： 1.抗体库技术省去了细胞融合的步骤,省时省力,避免了因杂交瘤不稳定而需要反复亚克隆的繁琐程序。 2.扩大了筛选容量,用杂交瘤技术一般筛选能力在上千个克隆以内,而抗体库可筛选106以上个克隆。 3.抗体库技术直接得到抗体的基因,既无杂交瘤丢失之虞,又便于进一步构建各种基因工程抗体。 4.抗体库技术得到的抗体可以在大肠杆菌表达,可利用原核表达系统的优势。 5.一些难于制备的抗体,如针对弱免疫原、毒性抗原的抗体,以及人源抗体的制备可以得到解决。 组合抗体库技术出现后不到一年, 即被噬菌体抗体库技术所代替, 该技术是在噬菌体表面展示(phage display)技术基础上建立起来的, 是迄今为止发展最成熟、应用最为广泛的抗体库技术。 1985年Smith — 证实噬菌体fd基因组能通过基因工程的手段进行改造。 1988年Parmley — 将已知抗原决定簇与噬菌体PⅢ N端融合呈现在其表面。 1990年McCafferty — 用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一个广泛应用的时代。 一系列噬菌体文库的构建—噬菌体展示技术焕发出了新的生命力。 噬菌体抗体库技术(phage display antibody library techniques) 是指用聚合酶链反应(polymerase chain reaction ,PCR) 扩增抗体的全套可变区基因,通过噬菌体表面展示技术,把Fab 段或单链抗体(ScFv) 表达在噬菌体的表面,经过“吸附-洗脱-扩增”过程筛选并富集特异性抗体。 构建Fab抗体库和ScFv抗体库的差别２８５页 免疫球蛋白基因可来源 杂交瘤细胞 体外免疫的细胞 致敏及非致敏的B 淋巴细胞(骨髓、外周血) 病灶局部引流淋巴结 扁桃体或经过免疫的小鼠脾脏等 其中以淋巴结的B 淋巴细胞较好 表达载体 噬菌体抗体库的表达载体可分为λ 噬菌体(phageλ) 、单链丝状噬菌体(filamentous phage) 及噬菌粒(phagemid) 三种系统 噬菌粒是应用最多的表达载体,也是简便高效模拟B 细胞产生抗体的原核表达系统。 经典的筛选方法有两种290页 一是将纯抗原包被在固相介质上,如酶标板、免疫试管或亲和层析柱,然后加入待筛选的噬菌体,洗去非亲和性的噬菌体,回收高亲和性的噬菌体。（固相筛选） 二是将抗原与生物素基团相连,再将其固定在包被有链霉蛋白抗生素的顺磁珠上对噬菌体进行筛选。（液相筛选） 　三、噬菌体抗体库技术优势 （一）能模拟天然抗体库,不需要免疫人和动物 在噬菌体抗体库中, 含有人抗体各种基因信息的全部mRNA ,为全套抗体基因的获得提供了良好材料。 构建噬菌体抗体库时,抗体重链基因和轻链基因在体外的重组,造成重、轻链间的配对具有很大的随机性, 一般认为,107个特异性抗体分子就能识别全部抗原决定簇的99 %。因此,构建一个库容量为108的组合噬菌体抗体库,理论上认为基