CRISPRCas9系统在果蝇基因组改造中的应用.docx

福建省科协第十四届学术年会农业分会暨华东地区农学会学术年会CRISPR／Cas9系统在果蝇基因组改造中的应用陈思琪，王亚芳，陈倩倩，顾莹，彭继成，邱亚铁福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福州摘要：由于CRISPR／Cas9系统具有改造基因组工程的潜能，现已受到广泛关注。研宄表明，由 RNA指导的Cas9核酸酶可以被用于果蝇基因组工程改造，而且这些被修饰的基因可以通过种系有效的遗传。目标RNA链可以引导Cas9到特定的基因组序列，从而诱导双链断裂，但修复不完全可 能会产生突变。不仅如此，两条目标RNA链还可使基因组发生大量的基因缺失并通过同源重组催 化发生替换。锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)在果蝇中也有类似的功能。在果蝇子代中。目标RNA可以越过独特的定向核酸序列调控特异性修饰位点，使得CRlSPR／Cas9系统更容易进行基因编码。就目前的规划现状，在一个月内可以获得相应基因组改造的果蝇。CRISPR／Cas9系统可以沿着关键基因开始，进行特定的CRISPR基因改造工程，使多种基因组被修饰。关键词：CRISPR：Cas9：基因组构建：同源重组：定点诱变1引言在活细胞中，CRISPR／Cas9系统可以精确修改基因组，是生物医学中长期发展的方向。在临 床医学上，这样的基因疗法可以修复受损基因，为了研究它们的功能，在实验室中通常被用来选 择性地操纵基因组元件。在果蝇体内，多种进行精确的基因组编辑方法已经成功研发【1．7l。然而，这种方法对时间和劳动力的需求限制了基因组工程技术在果蝇中的广泛应用。该CRISPPJCas9系统则有望改变这一点。经实验证实，CRISPR／Cas9调控的基因修饰可以在果蝇内有效的生成并通过生殖细胞传递基因is_lo]。内源性的CRISPRRNA／Cas9系统由一条的多肽核酸单链和Cas9组成，Cas9被两个复合小CRISPRRNA(crRNA)引导进入靶位点。Cas9系统包含靶向序列和一个共同的反式激活CRISPRRNA(tracrRNA)IllJ2]。在基因组工程改造中，化脓性链球菌系统通过嵌合RNA的传递被简化为2个部分组成(chiRNA或向导RNA[gRNA】)，包括所有关键crRNA和tracrRNA序列f12】。该2组分体系只需要一条gRHA单链识别三核苷酸NGG(PAM)相邻的20个核苷酸的靶序列，以指示该靶序列内两条DNA链在Cas9诱导下进行依赖性裂解B2】。经过长期的研究证明，这个简单的系统能有效地作用在哺乳动物细胞系，人类干细胞，酵母，细菌，小鼠，斑马鱼，虫，和苍蝇的突 变中Is·l0】【13-24]，具有一定的实用性。2CRISPR与工程多样基因组的修饰在CRISPR／Cas9系统适用于果蝇后，被成功地用来产生各种复杂的修饰基因组，其应用的可 能性的扩大几乎是不受限制的[840】。该系统在果蝇上的应用是最普遍的，也是该领域研究的重点。2．1敲除诱导染色体DNA双链特异性位点断裂可以产生突变，这是由于非同源末端连接错误而发生了 不准确的修复。这种具有错误修复倾向的过程可以在破坏基因功能的切割位点产生小的插入和缺第208页福建省科协第十四届学术年会农业分会暨华东地区农学会学术年会失(插入缺失)。另外，我们以Cas9为靶，用4种不同的gRNAs插入黄眼和红眼基因，并观察通 过生殖系遗传后的每一个靶位点所发生的移码突变【9】。Bassett等人(2013)和Yu等人(2013)通过Cas9诱导非同源末端连接来扩增突变位点的数量，并观察在9．12个靶位点中插入8个基因后基因在种系中高效传递的现象。然而，随意的插入和缺失可能会破坏基因的功能，精确的敲除基因或其他基因组序列就可以 正确的表达。为了精确的敲除黄眼基因，我们同时采用2个gP．NAs，一个从5’端开始，另一个从3’端开始。采用这种方法，我们可以精确的切除4．6-kb黄眼基因得到稳定的转化株，以及在敲除部分基因后导致黄眼功能缺失的果蝇【9l。同时，采用多个gRNAs可以同时用来敲除整个开放阅读框， 我们可以成功敲除6．1-kb红眼基因。2．2敲入除了非同源末端连接，染色体DNA中的目标DNA双链断裂后也可以作为修复的模板用于催化同源重组(I-IR)。将基因与一个(I)C31噬菌体attP重组位点发生置换时，可以使用两个gRNAs将黄眼基因旁边的序列和单链寡核苷酸(ssODN)作为模板，用attP重组位点取代内生性的黄眼 基因【9】。这一结果表明，该系统可以在果蝇体内用于同源性的基因组改造。研究表明，在果蝇体内靶向插入外源序列，可以使用可编码的CRISPR／Cas9系统将通道打开， 使多种基因组被修饰。这种方法可以引入特定的点突变，标记内源基因座，或进行重组位点的侧翼等位基因的条件性敲除。这些做