生物化学仪器分析紫外.pptx

第3章 紫外光谱—Ultraviolet Spectrometry, UV主讲：孙立权§3.1 紫外吸收光谱分析基本原理Principles of UV3.1.1紫外吸收光谱的产生3.1.2有机物紫外吸收光谱3.1.3有机物紫外吸收光谱3.1.4蛋白紫外吸收光谱3.1.5核酸紫外吸收光谱3.1.6紫外吸收光谱影响因素3.1.7 显色反应41e2λ3 250 300 350 400nm§3.1 紫外吸收光谱分析基本原理Principles of UV3.1.1 紫外吸收光谱的产生Formation of UV1.概述基于物质对紫外光选择性吸收的分析方法。2.物质对光的选择性吸收及吸收曲线M + 热M + h? → M *基态 激发态E1 （△E）E2M + 荧光或磷光?E = E2- E1 = h?量子化 ；选择性吸收??定性依据。3.1.1 紫外吸收光谱的产生Formation of UV可见—紫外波长范围：100-800 nm.(1) 远紫外光区: 100-200nm (2) 近紫外光区: 200-400nm(3)可见光区:400-800nm3.1.1 紫外吸收光谱的产生Formation of UV可见光谱与紫外光谱的共同之处光谱法：可用于结构鉴定、定性和定量分析；定性依据：特征吸收；定量依据：朗伯—比耳定律；能级跃迁：分子中价电子能级跃迁；光谱形状：电子跃迁的同时，伴随着振动、转动能级的跃迁??带状光谱。3.1.1 紫外吸收光谱的产生Formation of UV可见光谱与紫外光谱的共同之处吸收曲线（A-λ曲线）吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。关于吸收曲线的讨论与可见光谱相同3.1.1 紫外吸收光谱的产生Formation of UV3.电子跃迁与分子吸收光谱物质分子内部三种运动形式：（1）电子相对于原子核的运动；（2）原子核在其平衡位置附近的相对振动；（3）分子本身绕其重心的转动。3.电子跃迁与分子吸收光谱分子具有三种不同能级：电子能级、振动能级和转动能级三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量。分子的内能：电子能量Ee 、振动能量Ev 、转动能量Er即Ｅ＝Ｅe+Ｅv+ＥrΔΕeΔΕvΔΕr 3.电子跃迁与分子吸收光谱能级跃迁电子能级间跃迁的同时，总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。讨 论转动能级间的能量差ΔΕr：0.005～0.050eV，跃迁产生吸收光谱位于远红外区。远红外光谱或分子转动光谱；振动能级的能量差ΔΕv约为：0.05～１eV，跃迁产生的吸收光谱位于红外区，红外光谱或分子振动光谱；电子能级的能量差ΔΕe较大1～20eV。电子跃迁产生的吸收光谱在紫外—可见光区，紫外—可见光谱或分子的电子光谱。 讨 论吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性的依据。吸收谱带的强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有关，也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测得的摩尔吸光系数εmax也作为定性的依据。不同物质的λmax有时可能相同，但εmax不一定相同；吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比，定量分析的依据。s *nHCOsp *?EHKRnp,EBps3.1.2 有机物紫外吸收光谱Ultraviolet spectrometry of organic compounds1．有机化合物电子类型及电子跃迁类型三种价电子：σ电子、π电子、n/p电子；电子跃迁类型：n→π＊；π→π＊； n→σ＊；σ→σ＊ 。§3.1.2 有机物紫外吸收光谱Ultraviolet spectrometry of organic compounds分子轨道理论：成键轨道—反键轨道。当外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态(反键轨道)跃迁。主要有四种跃迁，所需能量ΔΕ大小顺序为：n→π＊ π→π＊ n→σ＊ σ→σ＊2　σ→σ＊跃迁所需能量最大；σ电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁；饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区；吸收波长λ200 nm；例：甲烷的λmax为125nm , 乙烷λmax为135nm。只能被真空紫外分光光度计检测到；作为溶剂使用。3　n→σ ＊ 跃迁所需能量较大。吸收波长为150～250nm，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观察到。末端吸收。含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤素等杂原子)均呈现n→σ＊跃迁。4 π→π＊跃迁所需能量较小，吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区，εmax一般在104L·mol－1·cm－1以上，属于强吸收。 （1） 不饱和烃π→π*跃迁乙烯π→π*