smallrna文库构建1.docx

总RNA的提取1.实验前用75％酒精擦一遍实验台桌面和移液器，再用RNase exitus plus喷擦一遍实验台桌面和移液器。2.将样品放至研钵中，倒入液氮将组织磨碎后，分装至盛有Trizol的试管中，将试管放至4℃冰箱备用。3.将试管中混合溶液分装至1.5mL Ep管中，加200μL三氯甲烷，12000g离心15min。吸取上清并转移至新Ep管中，加三氯甲烷，12000g离心10min。4.收集上清液至新Ep管中，加500μL异丙醇，混匀，并在-20℃冰箱沉淀30min。取出后离心10min，并弃上清液。5.每管加入500μL 80％乙醇清洗沉淀，12000g离心7min，弃上清液。再次离心5min，用枪头小心吸去水层，将Ep管敞口放至通风橱10min，干燥。6.每管加入21μL DEPC处理过的水，混匀。取1μL用于跑电泳，剩余放至-80℃冰箱，备用。用30mL 1×TBE溶解0.3g琼脂糖，加热至沸腾，取20μL染料加入其中，倒胶，插梳子。7.跑胶：110v电压，30min。将胶块取出放至可见光透射仪上观察总RNA条带，若需图片则将胶块放至凝胶成像系统，拍照。Small RNA的分离1.用3％H2O2（40mL 30％H2O2 + 400mL DEPC treated water）浸泡梳子、2套电泳板并胶槽10min，然后用DEPC－treated water 冲洗，并放至55℃烘箱干燥，冷却。2.将电泳板装至电泳槽中，配制10％过硫酸铵（0.1g+1mL DEPC treated water），从-20℃冰箱中取出配好的尿素母液并加热溶解，TEMED，三者配比如下：尿素过硫酸铵TEMED10mL44 mL7.5μL8mL35 mL6μL45mL170mL30μL90mL350mL60μL（1）15％聚丙烯酰胺-7M尿素母液的配制（500mL）尿素230.4gdd H2O97.2mL丙烯酰胺-甲叉丙烯酰胺母液180mL5×TBE（先配10×）21.6mL配加完后，用0.45μm过滤器过滤尿素母液。（2）10×TBE配制（1000mL）Tris121.1g1M硼酸51.3g0.83MNa2EDTA3.72g10mM超纯水定容至1000mL。（3）40％（37.5:1）丙烯酰胺-甲叉丙烯酰胺母液的配制（1000mL）丙烯酰胺375g甲叉丙烯酰胺10g超纯水定容至1000mL，4℃保存。3.将此混合溶液迅速倒入电泳槽（尿素需冷却至室温再混合溶液），放卡好楔子，凝固后将梳子拔出。加入约300～600mL的1xTBE缓冲液于胶槽底部，再加入约100mL缓冲液于胶块与夹板，使缓冲液充满其中。设定电泳仪参数，电压170v，时间30min，开始跑电泳。4.RNA样品预处理上样buffer工作浓度母液15μL体系20μL体系25μL体系TBE0.22510×0.750.450.56RLB（buffer）1×10×1.5（1,0.5）22.5（1.5,1）甲酰胺50％7.51012.5RNA溶液5.257.559.445.暂停预电泳，用注射器吸取缓冲液清洗胶孔，加样（RNA需处理后加样：放至PCR仪65℃变性2min，再放至冰浴3min）。分设置Marker孔（上述三种溶液+3μLMarker）、空白孔（不加RNA，用DEPC treated water补足）、样品孔（三种溶液+RNA溶液），设置电泳仪参数170v，1h，开始。注意：两侧胶孔应点空白。6.回收small RNA胶：100mL TBE+15μL染料混匀，取出胶块放至其中10min，用TBE清洗一次。（若拍照则将胶块放至成像仪中拍照再切胶），带黄眼镜切胶18-30nt范围内，放至0.5mL管中（此管底部已扎孔且外套2mL管），封口膜缠住管口，离心12000g，7min。7.离心后弃掉0.5mL管，向2mL管中加入700μL -0.3M NaCl，用封口膜封口，置于混匀器上温和洗脱4h后，将溶液转至分离柱中离心12000g，5min。8.弃上层沉淀，收集下管液体，将其分装至两Ep管中，加3倍体积无水乙醇，且每管加入4μL糖原，充分振荡，放至-80℃冰箱沉淀，备用。9.取出已沉淀的Ep管，离心机预冷至8℃后离心12000g，30min。弃上清，用吸水纸将水分吸干，用80％乙醇清洗RNA沉淀，离心12000g，7min，弃上清。再离心12000g，5min，吸水纸吸干水滴，放至通风橱敞口干燥10min。10.向管中滴加8μL-DEPC treated water溶解沉淀，如剩余两管则放至-80℃冰箱，备用。接头连接、RNA反转录、PCR扩增3’接头 (1μM)的连接Small RNA (10 μg total RNA)7μL3’AP(rApp) (1μM) 1μLHeat 70