三维荧光F4500presentationJapan.ppt

1/56 1/56 荧光偏光法是什么 ：针对激发一侧偏光镜的平行成分 的荧光強度 ：针对激发一侧偏光镜的垂直成分 的荧光強度 P: 偏光度 P: 偏光度 P0:在绝对0度时的偏光度 R：气体定数 T: 绝对温度 τ:荧光寿命 η：溶液的粘度 V: 荧光物质的 真实效果体积 荧光偏光法在生化学领域的应用例 荧光偏光度(mP)和分子量(M.W.)的关系 分子量的检测 荧光偏光法在生化学领域的应用例 样品： 荧光素(M.W.：389) 荧光素标识葡聚糖 (M.W.：3000，40000，70000) 检测条件： 激发波长：495nm 荧光波长：520nm 狭缝 ：5nm 光电倍增管电压：700V 蛋白水解酶(蛋白分解酵素)活性的检测 荧光偏光法在生化学领域的应用例 蛋白水解酶活性验出的原理 蛋白水解酶活性的高灵敏度验出 胰蛋白酶量 荧光偏光度 进一步添加 胰蛋白酶 胰蛋白酶量 荧光偏光度 荧光物质 温度刺激后在各个时间的荧光偏光度 荧光偏光法在生化学领域的应用例 细胞质流动性的检测 Fluorescein diacetate Fluorescein ?正常细胞 ?变异株细胞(让它从34℃到39℃变化的话 呈癌变细胞) 随着癌变偏光度就増加 细胞骨骼呈坚硬了 细胞内Ca2+的检测 细胞内Ca2+的检测 目的 解明细胞对刺激的反应 药物的生体活性的评价，细胞内机构的研究 例. 制药公司、生物的研究机构 细胞内Ca2+的检测 细胞情报的传达路径 小胞体 聍藏 细胞外信号 接受体 G蛋白质 磷脂酰肌醇-4 5-二磷酸 磷酸二酯酶 肌醇-1 4，5-三磷酸 甘油 细胞内Ca2+的检测 原理 Fura2-AM的构造 Fura2-AM Fura2-AM Fura2-AM 酯酶 Fura2 加水分解 疏水性 Ca2+ Fura2-Ca2+ 形成交错 激发光 荧光 亲水性 Fura2的特长 细胞 细胞膜 细胞内Ca2+的检测 Fura2的特长 Fura2-Ca2+ Fura2 300 350 400 激发光谱(nm) 荧光強度(Em：510nm) 0 500 根据与Ca2+的结合 荧光波长向短波长 一侧转换 365 335 细胞内Ca2+的检测 根据刺激负荷了Fura-2血小板的凝血素看荧光強度的经过变化 根据2波长测光法的检测 ???根据与 Ca2+结合的工作、利用荧光波长转换 刺激 破坏细胞膜 在细胞内Ca2+ 原来的荧光強度 全Ca2+原来 的荧光強度 解离Fura2-Ca2+ Ca2+为零时 的荧光強度 细胞内Ca2+的检测 其他的检测 药物的生体活性的评价，为了细胞内机构的研究 ｐH 或、Zn 也被检测。 发光能量移动现象在生化学领域的应用 发光能量移动现象(BRET)究竟是什么 ???由发光分子发生在接近于(1-10nm)分子的用高效率传达激发能量 　 的現象 根据发光能量移动现象的有无可以做推定分子間距离的工作 发光能量移动现象在生化学领域的应用 目的 发光能量移动现象的验出 可以推定在细胞内的蛋白质之間的距离 确认细胞内的情报有没有被传送着 解明细胞内的机构 例. 生物的研究机构 BRETが陽性になる場合 の概念図 BRET呈阳性时的概念图 * 和吸收光度法的不同点 １. 检测波长 吸光光度法 荧光光度法 不检测透过的光 检测(相同波长) 检测（不同波长） 检出的荧光波长比 激发光波长要长 ～斯托克司的法则～ 用强度100的光照射了 样品 用强度100的光照射了 样品 40透过了，也就是说 透过率是40%，有60%的光被样品吸收了 和吸收光度法的不同点 ２. 更高灵敏度 (a)吸收光度法 (b)荧光光度法 吸收分光光度计和荧光分光光度计灵敏度比较(単位：μg/mL)　 可以做到更低浓度的检测！ 蒽 硫酸奎宁 核黄素 若丹明 B 叶绿素 即使是低浓 度也只用稍 微看一下有 没有突起就 可以判断 浓 度 信 息 低浓度 的差值 不明显 黑 色 黑 色 样 品 的 透 过 高浓度 低浓度 高浓度 低浓度 样 品 透 过 和吸收光度法的不同点 ３. 信息量多(选择性高) 4. 荧光法的弱点 激发光谱 发射光谱 由于可以得到两个光谱、 比吸光光度法的信息量要多 在荧光光度法上，即使吸收波长相同 而荧光波长要不同的话也可以分析 １．不是所有化合物都出荧光的。 　　它能分析会发荧光的化合物。 ２．得到的荧光強度是相对値。 　　不同仪器其荧光強度会不一样。 荧光分光光度计的构造 荧光分光光度计的流程图 ?????? 根据监控传感器监视光源的光量変化 样品 箭头是光的行进方向 实线表示电气的连接 激发光源 转换电路 电 脑 半透半反镜 激发 监控 传感器 F-3010光学系