尚柏生物医学技术北京有限公司----技术资料ELISA的基本原理.DOCVIP

? 尚柏生物医学技术（北京）有限公司----技术资料 ? ELISA的基本原理、应用及方法 ELISA的基本原理有三条：? ????（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； ????（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；? ????（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。? ????ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面：?1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。?2、研究抗酶抗体的合成。?3、显现微量的免疫沉淀反应。?4、定量检测体液中抗原或抗体成份。 ? 　　1.　包被：用0.05M?PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。? 　　2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。? 　　3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。? 　　4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。? 　　5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。? 　　6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 ? 用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，?每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。? 　　　　　　　　　　　　　　↓? 加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)? 　　　　　　　　　　　　　　↓? 于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。? 　　　　　　　　　　　　　　↓? 其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。? ? ? ELISA中常见问题及解决方法 ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。我将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。? 下面分析Elisa试验操作中可能影响结果的原因，并给出相应的解决办法? ?? 选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。 ?? ?? 可能原因：??? 1）血清或血浆标本分离不好即进行加样；??? 2）手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)；??? 3）加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。??????? 解决办法：?????? 1)?标本为血清：最好将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟；标本为血???????? 浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次，???????? 放置一段时间后，3000rpm离心15分钟；若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，???????? 若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。??????2)?加样后及时放入孵箱。?????? 3)?加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。?????? 4)?如果采用AT或其他全自动加样，最好选择FAME或其他后