土壤中纤维素分解菌的分离鉴定.doc

土壤中纤维素分解菌的分离、鉴定以及酶活性分析 摘 要：纤维素是植物细胞壁主要成分，属于多糖类物质，是地球 上数量最大的可再生资源。如能利用微生物将其转化为生物产品或生 物能源，即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。由 于在自然界中存在着大量产纤维素酶的细菌和真菌，因而纤维素的生 物降解主要依赖于微生物的作用。从20世纪40-50年代起，针对产 纤维素酶的微生物的分离筛选就进行了大量的工作，并逐步建立起一 套较完整的分离筛选方法。迄今为止有关纤维素降解菌分离筛选的研 究报导已有很多，如细菌中的生孢噬纤维菌属、噬纤维菌属及纤维单 胞菌属等；放线菌由于能形成芽孢，与真菌相比较耐高温和各种酸碱 度，故在高温阶段放线菌对分解木质素和纤维素起着重要的作用。主 要有诺卡氏菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属及小单胞菌属等；真菌中 研究较多的是青霉属、根霉属、曲霉属等，其中以木霉属的菌株纤维 素酶活较高。以羧甲基纤维素钠和添加少量葡萄糖作为碳源，培养纤 维素酶产生菌株，培养一定时间后，经刚果红染色和稀碱液固定，在 菌落周围形成透明水解圈，根据透明圈的大小，快速定性鉴定纤维素 酶产生菌酶活大小。与传统纤维素酶活检测方法比较，本方法菌丝生 长快，两天后菌落经染色，透明圈边缘清晰，直观性强，与酶活力成 一定线性关系。 关键词：纤维素酶产生菌；鉴别培养基；透明水解圈 一、 实验原理： （一）纤维素与纤维素酶 （1）纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。 （2）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。 （二）纤维素分解菌的筛选 （1）筛选方法 刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。 （2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理 刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 二、实验材料及用具 （一）实验材料 （1） 样品的采集与处理 样品的采集： 采集土样时，应选择富含纤维素的环境。若找不到合适环境，可将滤纸埋在土壤中一个月左右，也会有能分解纤维素的微生物生长。 样品的处理：采集后的样品保存于4℃并在2d内使用。 （2）培养基 羧甲基纤维素钠（CMC-Na）固体培养基（1000ml） CMC-Na： 20g Na2HPO4: 2.5g KH2PO4: 1.5g 蛋白胨： 2.5g 琼脂： 20g pH： 7.0-7.5. （二） 仪器及用具 99ml无菌水（带玻璃珠，玻璃珠用量以充满瓶底为最好）1瓶，含9ml无菌水的试管6支，无菌培养皿，1ml无菌移液管，土壤样品，天平，称量纸，药匙，试管架，涂布器等。 三．操作步骤 （一）（二）（三）（1）（四） 选择培养 梯度稀释 将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 挑选产生透明圈的菌落