实验一微生物拮抗作用.doc

《生物技术大实验》讲义 实验一 枯草芽孢杆菌对棉花黄萎病的拮抗作用 实验目的： 进一步掌握无菌操作技术，加深对微生物之间互作的进一步认识 实验原理： 枯草芽孢杆菌分泌到体外的带谢产物能够抑制棉花黄萎病的生长 供试菌株 (1) 拮抗菌株: 枯草芽孢杆菌（冰箱保存） (2) 病原菌株: 棉花黄萎病菌（冰箱保存） 实验步骤 1. 培养基的制作 PD培养液：(2) PDA培养基：查氏培养液：按上述配方配制查氏液体50 ml及固体胶培养基125 ml分别装在250的三角瓶中，121℃ 条件下灭菌30分钟。 2. 接种培养 (1) 在无菌操作条件下，将棉花黄萎病菌接种在查氏培养液中，28℃振荡培养4天。 (2) 将枯草芽孢杆菌在PD培养液中28℃培养24小时 3. 抑菌试验 (1) 平板制备：将固体PDA培养基溶化后倒入培养皿中，制成平板 (2) 棉花黄萎病菌液涂皿：将棉花黄萎病菌液用玻棒均匀的涂布在查氏平板培养基上 (3) 枯草芽孢菌的接种：将圆滤纸片放置在平板培养基上，用吸管吸取少许枯草芽孢杆菌菌悬液滴到滤纸片上 (4) 培养：28 ℃培养箱中培养4天 (5) 观察结果 实验二 酶联免疫法测ABA含量 仪器： 酶联免疫仪 酶标板 752分光光度计 实验原理 本方法是一种固相抗原型酶联免疫法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA),先将ABA蛋白质复合物与固相载体(聚苯乙烯微量滴定板)结合,然后将待测的ABA(样品或标准品)和兔抗ABA抗体加入微量滴定板的孔中,进行竞争反应,接着弃去上清液,洗涤固相表面,加入酶标二抗使其与结合在固相ABA上的抗体反应,最后去除多余的未反应的酶标二抗,测定与固相结合的酶活性,酶活性和待测ABA含量呈负函数关系,即固相ABA结合的抗体与酶标二抗量(OD或B%)随待测ABA含量增加而减少,以一系列已知浓度的ABA的OD值制图而获得标准竞争性抑制曲线,对于未知样品B,只要在同样条件下测定反应后的OD值,就可以从标准曲线上查到ABA的量。 测定方法 包被：在微量滴定板内准确加入100μLABA包被液，37℃湿盒过夜。 标样稀释?：取8支试管每管加150μLDB，第一管中加入50μL（2000ng／50μL）标准液，充分涡旋后，取50μL至第二号管中，同样涡旋后，取50μL到第三管；依次稀释到第六管，稀释后的标准ABA依次为1000ng、500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng／50μL。 洗板：从37℃湿盒中取出滴定板，恢复到室温后，弃去包被液，用WB（洗涤缓冲液）洗涤三次，甩干（吸水纸）。 加样：1～8孔对应加入ABA标样50μL，10号孔相应加入最浓ABA标样，9号孔加50μLDB，三排重复；然后每孔加50μL抗体，37℃ 45分钟。 洗板： 加酶标二抗：每孔加100μL，37℃反应1小时。 洗板： 显色：各孔加10μLOPD显色液，37℃ 20分钟。 终止反应：各孔加50μL 6NH2SO4。 读数：490nm读取OD值。其中10号孔调零,而9号孔为最大值(B0),1~8号孔的OD值为B。 结果计算：以In（B/B0）∕（1－B/B0）为纵坐标，以标准ABA浓度的常用对数（lg［ABA］）为横坐标,绘制曲线。 实验三 质粒DNA的提取及其酶切 实验目的 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA 。 实验原理 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。 在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那木迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 实验步骤 提取质粒 将2 ml 含相应抗生素的LB液体培养基加入试管中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌单菌落，37℃振荡培养过夜。 取培养物倒入微量1.5ml离心管中，4000 r/min 离心 2 min。 弃上清，吸尽残液，使细胞沉淀尽可能干燥。 加入100ul溶液Ⅰ，充分混匀，室温放置10 min。 加200 ul溶液 Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖，轻轻颠倒数次混匀，将离心管放冰上 5 min 。 加入150 ul 溶液 Ⅲ（冰上