实验三、蛋白质的盐析透析　.doc

实验三、蛋白质的盐析透析　　 　　 蛋白质盐析　　 （一）目的要求 了解蛋白质的沉淀作用，加深对影响蛋白质胶体分子稳定性因素的认识。　　　 （二）实验原理　　 水溶液中蛋白质分子由于表面生成水化层及蛋白质分子上某些基团离子化而使蛋白质分子表面带有电荷，增加了水化层的厚度而成为稳定的亲水胶体颗粒，水膜和电荷一旦被除去，蛋白质颗粒将由于失去电荷和脱水而发生沉淀。　　　 向蛋白质溶液中加入无机盐（如硫酸铵、硫酸镁、氯化钠等）后，蛋白质便从溶液中沉淀析出，这种沉淀作用称为蛋白质盐析。其过程是一个可逆过程，当除去引起蛋白质沉淀因素后，被盐析的蛋白质仍可重新溶于水中，其天然性质不发生变化。　　　 用不同浓度的盐可将不同种类蛋白质从混合溶液中分别沉淀的过程，称为蛋白质的分级盐析。例如蛋清溶液中的球蛋白可被半饱和的硫酸铵溶液沉淀提取，饱和的硫酸铵溶液可使清蛋白沉淀析出。因此，盐析法常被用于分离和提取各种蛋白质及酶制剂。　 （三）试剂及材料　　 1、10%蛋清溶液 选新鲜鸡蛋，轻轻在蛋壳上击破一小孔，取出蛋清，按新鲜鸡蛋清1份，九份0.9%NaCl 溶液的比例稀释配制蛋清液，混匀，用四层纱布过滤后备用。　　　 2、饱和硫酸铵溶液 称取76.6g硫酸铵溶于100mL 25℃ 蒸馏水中。　　 3、固体硫酸铵。　　 （四）操作方法　　 1、取两支试管，分别加入10%蛋清溶液5 mL，饱和硫酸铵5 mL，静置5min，观察有否沉淀物产生，沉淀物为何物？　 2、取其一试管，用点滴管弃去上清夜，加水至沉淀物，观察沉淀是否会再溶解，说明沉淀反应是否可逆。　　 3、用滤纸把另一试管的沉淀混合物过滤，向滤液中添加固体硫酸铵至溶液饱和，注意观察溶液有否蛋白质沉淀产生，此沉淀又为何物？　　　 注意：把溶液中硫酸铵固体沉淀与蛋白质沉淀区别开来。　 二、蛋白质的透析　　 （一）目的要求 学习透析的基本原理和方法　 （二）实验原理 　　 透析是利用小分子能通过，而大分子不能透过半透膜的原理，把不同性质的物质彼此分开的一种手段。透析过程中因蛋白质分子体积很大，不能透过半透膜，而溶液中的无机盐小分子则能透过半透膜进入水中，不断更换透析用水即可将蛋白质与小分子物质完全分开。蛋白质和酶的提取过程，常用此法使之脱盐。　　　 如果透析时间过长，可采用低温条件下进行，以防止微生物滋长、样品变质或降解。　 透析袋材料通常有火棉胶、商品化透析袋等。　 利用硝酸银和双缩脲反应的透析结果进行检验：　　　 　 　　　 （三）试剂及材料　　　 1、氯化钠蛋清溶液 取一个鸡蛋清蛋白，加入30%NaCl溶液100mL、250 mL蒸馏水混合均匀后，四层纱布过滤。　 2、1%AgNO3 称取1g AgNO3 ,溶解于100 mL水中，贮存棕色瓶保存。　　 3、1%CuSO4 称取1g CuSO4，用水溶解并稀释至100mL。　　　 4、10%NaOH 称取10g NaOH，用水溶解并稀释至100mL。　　 5、5%火棉胶 分析纯。　 （四）操作方法　 1、透析袋的制备 直接把5%火棉胶试剂约10 mL倒入洁净、干燥的100mL三角锥瓶底部，然后徐徐转动三角瓶，使火棉胶由底部至瓶口均匀分布于瓶内壁，同时弃去多余的火棉胶，将三角瓶倒置，自然风干10min。小心剥离三角瓶口薄胶，引自来水沿瓶内壁与袋膜间流入，使透析袋与瓶壁逐渐分离，取出透析袋，同时检查透析袋的完好性。　　 2、透析 把10mL氯化钠蛋清液注入透析袋内，扎紧透析袋顶部，系于一横放在盛有蒸馏水的烧杯的玻璃棒上，调节水位使透析袋完全浸没蒸馏水中。　　 3、透析情况检验　 （1）无机盐透析检验：透析10 min后，自烧杯中取透析用水2 mL于试管中，用1%AgNO3检验氯离子是否能被透析出。　　 （2）蛋白质透析检验：自烧杯中另取透析用水2 mL于试管中，加入2 mL 10%NaOH，摇匀，再加1%CuSO4数滴，进行双缩脲反应，检验蛋白质是否被透析出。　 （3）不断更换烧杯中的蒸馏水以加速透析进行，经数小时侯烧杯中的水不再有氯离子检出为止，则表明透析完成。因为蛋清溶液中的清蛋白不溶于纯水，此时可观察到透析袋中有蛋白沉淀出现。　　 三、实验结果讨论分析。　　　 四、思考题　　　 1、制作透析袋时能否用采用热风干燥加速其成膜？为什么？　　　 2、高浓度的硫酸铵对蛋白质溶解度有何影响，为什么？　 3、盐析与透析在蛋白质、生物酶提取纯化中的意义。　 4、蛋白质可逆沉淀反应与不可逆沉淀反应的区别在哪里？举例说明。