实验三苯胺降解菌的分离筛选与降解特性测定.doc

实验三 苯胺降解菌的分离筛选与降解特性测定 一、目的要求 1. 学习从的基本原理与方法。 2. 的方法。 苯胺是苯分子中的一个氢原子为氨基取代而生成的化合物分子式C6H5NH2苯胺农药、医药随着工业的发展，环境。 是典型的高铁血红蛋白的形成体，使细胞失去携氧功能，具溶血作用，容易沉积于肝、肾和诱发营养不良等症状，也可以形成肝肾功能紊乱，引起贫血神经系统致敏作用。 利用微生物处理含苯胺废水具有高效、低耗、反应条件温、无二次污染的特点，已成为当前各国苯胺废水处理的重要途径和发展方向。国内外学者对苯胺降解菌开展了大量的研究工作，已筛选到一些高效降解菌。已发现的苯胺降解菌以好氧菌为主，包括诺卡氏菌属(Nocardia)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、产碱菌属(A lcaligenes)、苍白杆菌(Ochrobactrum)、不动杆菌属(Acinetobater)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)等；可降解苯胺的厌氧菌有苯胺脱硫杆菌((Desulfobacteriu m aniline)和兼性厌氧菌HY99。多数好氧菌主要通过邻位代谢途径降解苯胺，最终产生三羧酸循环的中间产物琥珀酸和乙酰辅酶A(图14.1)；也有部分好氧菌，如粪产碱杆菌(A. faecalis)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等同时还具有间位代谢途径，终产物为丙酮酸和乙醛(图14.2)。在厌氧条件，苯胺可以在硫酸盐的还原条件下或是硝酸根还原条件下，生成4-氨基苯甲酸盐，然后通过4-氨基苯甲酰辅酶A去氨基，然后再进一步代谢分解。 图14.1 苯胺的邻位代谢途径 图14.2 苯胺的间位代谢途径 三、主要实验材料 (一)样品来源 采集含苯胺污水和底泥样品或含苯胺废水曝气池的活性污泥样品。 (二) 培养基与主要试剂 1.主要培养基 (1)无机盐培养基 NaH2PO4 0.2 g，Na2HPO4 0.4 g，(NH4)2SO4 2.0 g，MgSO4 0.1 g，KCl 0.2 g，Fe(NO3)3 8 mg，无离子水1000 mL，pH7.0(Nishino SF et al., 1995)。 (2)分离培养基 每1000mL无机盐培养基中添加葡萄糖0.5 g，蛋白胨0.3 g，酵母膏0.3 g，琼脂18 g，pH7.0。 (3)传代培养基 牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂18 g，无离子水1000 mL，pH7.0。 以上培养基121℃灭菌20min。 (1) 硫酸氢钾(KHSO4)。 (2) 无水碳酸钠(Na2CO3)。 () 50g/L亚硝酸钠(NaNO2)：贮于棕色瓶中，置冰箱内保存。 () 25g/L氨基磺酸铵(NH4SO3NH2)：贮于棕色瓶中，置冰箱内保存。 () 20g/L N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐：贮于棕色瓶中，置冰箱内保存 (6) 0.05mol/L硫酸标准溶液。 苯胺(C6H5NH2)标准贮备液：于25mL容量瓶中加入0.05molL硫酸溶液10mL，称量(称准至0.0001g)，加入3～5滴苯胺试剂，再称量，用0.05molL硫酸溶液稀释至标线，摇匀。计算出每毫升溶液中所含苯胺的量，此为贮备液，置冰箱内保存(可用两个月)。注：如果苯胺试剂为无色透明液，可直接称量配制。若试剂颜色发黄，应重新蒸馏或标定苯胺含量后使用。 苯胺标准使用溶液：将标准贮备液用0.05molL硫酸溶液稀释成浓度为10.0μgmL的标准使用溶液(临用时配)。 蒸馏水，pH0.5～5.0精密试纸 (三) 主要仪器 二级生物安全柜(或超净工作台)，恒温振荡器ZHWY-2102型离心机250B), 722型分光光度计 四、基本步骤 (一)苯胺降解菌的富集培养 取5mL污水样品或5 g污泥样品，加入盛有100 mL无机盐培养基（添加苯胺至200mg/L）的锥形瓶内，28℃、180 r/min条件进行振荡培养。每隔24 h镜检观察形态、测定pH，定时加苯胺，以确保污泥有足够的营养源并逐步提高其浓度。 (二)苯胺降解菌的分离 (三)苯胺降解菌的纯化 用平板划线法在传代培养基平板上进行纯化，将纯化得到的单菌落保存于传代培养基斜面上备用。 (四)苯胺降解菌降解活性的测定 苯胺含量的测定采用萘乙二胺偶氮 1. 苯胺标准曲线的制作 取7个25mL具塞刻度试管，分别加入苯胺标准使用溶液0.0、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00mL，分别加蒸馏水至10mL。1滴50gL亚硝酸钠溶液，摇匀，放置3min加入25gL氨基磺酸铵溶液0.5mL，充分振荡后，放置3min，待气泡除尽(以消除过量的亚硝酸钠对测定的影响)加入20gL N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐溶液1.0mL，用水稀释至