实验二_离子交换柱层析法分离氨基酸.ppt

目的要求 （1）学习采用离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。 （2）掌握离子交换柱层析法的基本操作技术。 一、原理 离子交换层析是用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。 ?? 即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程。 带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。 所用样品为天冬氨酸(pI2.77)和赖氨酸(pI9.74)的混合液，分别属酸性氨基酸、碱性氨基酸，在缓冲溶液(pH5.3)中分别带负电荷和正电荷，与732型阳离子交换树脂的亲和力有很大不同，在一定的洗脱条件下洗脱，将它们分离。 利用氨基酸可与茚三酮反应生成有色化合物进行氨基酸鉴定。 离子交换剂的种类 在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即离子交换剂。 （一）按活性功能基团带电荷性质不同 阳离子交换剂 — 带负电荷，与阳离子交换 阴离子交换剂 — 带正电荷，与阴离子交换 （二）按载体种类不同 1.离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂 交联度大，网孔变小，大分子量的离子不能进入树脂颗粒内发生离子交换。 在不影响分离的情况下，以采用交联度较高的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的选择性 。 2.离子交换纤维素 阴离子交换纤维素 —如:DEAE-纤维素 pH8.6以下分离中性或酸性物质,具二乙胺乙基 阳离子交换纤维素—如:CM-纤维素 一般pH4条件下使用,具有羧甲基 3.离子交换凝胶— 分离大分子物质 如：葡聚糖（Sephadex）、 聚丙烯酰胺（PAG）、琼脂糖（Sepharose） 二、器材 ?? 层析柱、分光光度计、水浴锅、烧杯、刻度吸管等 三、试剂 阳离子交换树脂 pH5.3柠檬酸缓冲液 样品液：氨基酸混合液（天冬氨酸-赖氨酸） 0.1%CuSO4 0.5%茚三酮 操作步骤 1、装 柱 阳离子树脂，柱 高：6cm-8cm 2、平 衡 流速：0.4 ml/min，进出口液体pH 值相等。 3、上 样 0.5ml 4、洗 脱 流速： 1滴/5秒 5、收 集 4.0 ml/管，10-15管 6、测 定 波长：570 nm 实验步骤 1．树脂的处理 将干的强酸型树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。用4倍体积的2mol/L的盐酸浸泡1小时，倾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氢氧化钠处理，做法同上。最后用欲使用的缓冲液浸泡。 2．装柱 取层析柱。将柱垂直置于铁架上，关闭出口，加入柠檬酸缓冲液约1cm高，自顶部注入树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量溶液，再加入一些树脂，至树脂沉降至6 ~ 8cm的高度即可。 装柱要求连续、均匀，无纹格、无气泡，表面平整。液面不低于树脂。 3．平衡 从层析柱加将缓冲液瓶，树脂表面保持3－4cm液层，开出口，以0.4ml/min流速平衡，直至流出液pH与洗脱液相同（用pH试纸检测）。 4. 加样 揭去层析柱上口盖子，待柱内液面至树脂表面1－2mm关闭出口，沿管壁四周小心加入0.5ml样品，慢慢打开出口，同时开始收集流出液。当样品液弯月面靠近树脂顶端时，即刻加入少量柠檬酸缓冲液冲洗加样品处数次，然后注入柠檬酸缓冲液，树脂表面保持3－4cm液层。 5. 洗脱 以缓冲液洗脱，流速保持1滴/5秒，用试管收集洗脱液，每管收集4mL，共收集10—15管。 6．洗脱及氨基酸的鉴定 分别取各管收集液1mL，各加1mL水合茚三酮显色剂并混匀，在沸水浴中准确加热5min后冷却至室温，再各加入3mL的0.1%硫酸铜溶液。混匀，测定A570波长的光吸收值，以光吸收值为纵坐标，以洗脱液累计体积为横坐标绘制洗脱曲线。 操作步骤 1、装 柱 阳离子树脂，柱 高：6cm-8cm 2、平 衡 流速：0.4 ml/min，进出口液体pH 值相等。 3、上 样 0.5ml 4、洗 脱 流速： 1滴/5秒 5、收 集 4.0 ml/管，10-15管 6、测 定 波长：570