实验二、福林-酚试剂法测定测定蛋白质的含量.ppt

实验二、Folin—酚法测定蛋白质的含量 一、原理 可溶性蛋白与Folin—酚试剂反应， Folin—酚试剂在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色复合物，蓝色的深浅与蛋白质的含量呈正比。因为蛋白质中含有酚基的氨基酸。根据蓝色深浅测定消光值即可求出可溶性蛋白质的含量。 这两种显色反应产生深兰色的原因是： ?在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 ?Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。 此法可检测的最低蛋白质量达5?g。通常测定范围是20~250?g 二、材料和试剂 1、标准蛋白质 250ug/ml 牛血清白蛋白溶 于重蒸水溶液 2、Folin—酚试剂甲 A0.2MNaOH+4%NaCO3 等体积混合 配100ml B2%酒石酸钾钠+1%CuSO4.5H2O 等体积混合 配10 ml 当天使用时混合有效A 100ml+B 2ml 3、 Folin—酚试剂乙 吸取5ml苯酚+5ml水，用0.1MNaOH滴定至酸浓度为1M 附：乙试剂配制方法： 在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠(Na2WO4·2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。 4、 分光光度计 5、恒温水浴锅 6、蛋白质样品溶液 A：鸡蛋清白蛋白 100-250ug/ml 的重蒸水 B：土豆 取样品用水冲洗干净，用纱布擦干，立即称取1-5g鲜样，置研钵中加重蒸水少许及石英沙，研磨成匀浆，过滤弃去残渣，定容至50 ml,滤液经6000 r/min离心30分钟，取上清液待测。 五、 操作 1、标准曲线制作： 各吸取 0、0.2 0.4 0.6 0.8 1.0ml标准蛋白液于带塞小试管，分别加入不同量的蒸馏水到1ml ，各加5ml 试剂甲，混匀后室温下（25℃）放10分钟，加入 0.5ml试剂乙，立即混匀，25℃左右反应30分钟，于500nm波长下测定消光值，以OD500为纵坐标，含量为横坐标，绘出标准曲线，（浓度低时可用OD750nm） 2、样品测定 取0.2、0.4、 0.6ml样品液加5ml 试剂甲，混匀后室温下（25℃）放10分钟，加入 0.5ml试剂乙，立即混匀，25℃左右反应30分钟，于OD500nm波长下测定消光值，从标准曲线上查出蛋白质的浓度。 注意： 1、因Folin—酚试剂反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定吸光值。每分钟测一个样品。 2、Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin－酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白 质作用生成碱性的铜－蛋白质溶液。当Folin－酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还原反应产生在磷钼酸－磷钨酸试剂被破坏之前。 3、样品稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将样品酌情稀释。 六、结果 1、标准曲线 2、样品蛋白质浓度 七、思考题 1.?Folin－酚测定蛋白质的原理是什么？ 2.有哪些因素可干扰Folin－酚测定蛋白含量？ 3.含有什么氨基酸的蛋白质能与Folin-酚试剂呈蓝色反应？ 4.测定蛋白质含量除Folin-酚试剂显色法以外，还可以用什么方法 八、分析讨论 * * 五种蛋白质测定方法比较如下： ? 方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法 （Kjedahl法） 灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ?2％ 费时 8～10小时 将蛋白氮转化为