DAPI标记的原理.doc

DAPI标记的原理，应用以及优缺点一、DAPI的特性DAPI荧光染料是由Dann等人于1971年合成的，共化学名称为4,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) 的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，其结构式为 是一种常用的荧光染料，分子量为350．3．这种二价阳离于的荧光染料是一种黄色晶体易镕于水，最大溶解度为2．5％．可按高浓度的两价或高价阴离于(硫酸盐离子和磷酸盐离子)所沉淀，其作用机理与溴化乙锭等染色剂的机理类似：DAPI具有与各种来源的、富古A—T碱基对的DNA专一结合的特点．DAPI与DNA形成的复合物发出志强度的浅蓝色荧光．共最大的激发波长为372nm，最大的发射波长为454nm，其荧光可按适当浓度的SO42－加强． DAPI最初是作为一种杀锥虫剂合成的，以后用于DNA的检测．Brunk等和Coleman等人证明了DAPI荧光强度与细胞内的DNA含量呈正比，并指出，在pH4—8范围内，DAPI－DNA 复合物的荧光强度不受pH变化的影响．用DAPI染色法可以测出2x10－16g DNA。近年来，DAPI多用于细胞生物学和细胞遗传学的研究，由于死、活细胞的细胞膜对DAPI的通透性不同，极低浓度(0.5ug／ml)的DAPI就可与死亡细胞的DNA结合，产生明亮而稳定的荧光，所以人们开始把这一理想的话体荧光染科用于微生物、植物和动物细胞的细胞生物学和生物化学的研究。作为一种新型的DNA荧光染科，它具有专一性强、灵敏度高、稳定性好等特点，而且迄今尚来见到DAPI致癌。致畸等毒性报告．有文献称之为无毒性荧光染料(Renard，1982)．利用DAPI能与细胞DNA稳定结合这一特性，最近被人们用于干细胞的体内示踪。如造血干细胞和间充质干细胞的体内移植。DAPI是一种标记细胞核的荧光染料，因其与dsDNA有高度的亲和力，与DNA结合后会发出强烈的荧光。DAPI对活细胞无毒性，不改变细胞器的超微结构，荧光保持时间较长。文献显示DAPI标记的肌卫星细胞移植到宿主心肌2月后仍然可以看到。但DAPI在电镜下没有显示，若进行超微结构追踪观察需结合其它特殊的抗体标记。二、方法Cells主任介绍了利用DAPI染色标记细胞核的方法：实验用具及材料 试剂：PBS, 胎牛血清（FBS）,固定液, DAPI染色液, DMEM培养基, 胰酶（Trypsin）器材：培养皿, 15ml离心管, 试剂瓶, 微量移液器, 脱色摇床, 锡箔, 荧光显微镜和CCD溶液配制（1）固定液：将4g多聚甲醛加入80mlPBS中，搅拌过夜或者搅拌过程中微热直至固体全部溶解，定容至100ml就成为4％的多聚甲醛固定液。 （2）DAPI染色液：在500ml水中加入8.5gNaCl和1.2gTris碱，用盐酸调pH值至7.4，再加入4ml 500mM的CaCl2和44ml 500mM的MgCl2以及0.05g的BSA；最后加入10mg的DAPI和100ml的DMSO，定容至1L，4度保存。实验步骤（1）转染两天后的细胞吸取培养基后，PBS洗一次。 （2）用4%的多聚甲醛PBS在室温固定15分钟。 （3）用PBS在室温漂洗三次，每次10分钟。 （4）用含0.5%Triton-X-100的PBS在室温穿孔15分钟 （5）用PBS在室温漂洗三次，每次10分钟。 （6）加入DAPI染色液室温作用15分钟以上，此后用锡箔包裹。 （7）用PBS在室温漂洗三次，每次10分钟。 （8）再荧光显微镜下观察，用UV波段激发，照相保存实验结果。Cells主任由介绍了MSC的标记方法：MSC-DAPI 标记: 将无菌的DAPI 储存液(美国Sigma 公司) 加入培养的MSC 上清中,至终浓度为50 mg/ L ,37 孵育染色至少30 min。细胞至少用Hanks 平衡盐溶液冲洗6 遍以除去未结合的DAPI。离心收集细胞,用无血清的DMEM 悬浮至移植所需浓度,置于冰上至少1 h 备用。贴张图，比较形象生动。 摘自：中华医学杂志2003 年11 月25 日第83 卷第22 期骨髓间充质干细胞在激光损伤大鼠视网膜下分化的观察。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。三、不足但DAPI也有一定的不足：1、DAPI除与DNA双链结合外，还可与细胞浆中的微管蛋白结合，故胞浆也着蓝色。DAPI标记细胞的很大不足就是当标记细胞死亡后，就可以释放出DAPI，将周围未标记的细胞标记，从而产生假阳性，这也是我们用这类荧光染料标记细胞时必须考虑的问题。 文献报道骨髓间充质干细胞可以用绿色荧光蛋白（GFP）来标记，