(三)RNA的二级结构.ppt

(五)变性和复性 1.概念 核酸的变性是指双螺旋区氢键断裂,空间结构破坏,形成单链无规线团状态的过程,变性只涉及次级键的变化,故一级结构没有变化. 能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。 核酸的变性与复性 RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有DNA那样明显。 利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。 因为天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸收(260 nm)值增加25－40%.而RNA变性后，约增加1.1%。 增色效应：变性后DNA对260nm紫外光的吸收率（A260）比变性前明显增加，这种现象称为增色效应. A260值增加 粘度下降 浮力密度增大 分子量不变 2.DNA变性后的表现 DNA的热变性和解链温度（Tm） 用加热的方法使DNA变性叫做热变性 DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将DNA的变性达到50%时，即增色效应达到一半时的温度称为DNA的解链温度（melting temperature,Tm）,Tm也称熔解温度或DNA的熔点。 一般DNA的Tm值在70-85?C之间 RNA的T m值 tRNA的T m值 DNA变性（加热或极端pH） 当DNA的稀盐溶液加热到80-100℃时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。 DNA变性后，它的一系列性质也随之发生变化，如紫外吸收(260 nm)值升高, 粘度降低等。 3.影响Tm的因素 (1)G-C对含量:G-C对含量愈高,Tm愈高,经验公式为: (G+C)%=(Tm-69.3) ╳2.44 (2)溶液的离子强度:离子强度较低的介质中,Tm较低. (3)溶液的pH:高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力,pH大于11.3时,DNA完全变性,pH低于5.0时,DNA易脱嘌呤. (4)变性剂:甲酰胺,尿素,甲醛等可破坏氢键,妨碍碱基堆积,使Tm下降. （5）DNA的均一性：均一性愈高的样品，熔解过程愈发生在一个很小的温度范围，即Tm较低。 核酸 G+C 組成分越高者 Tm 越大 70 80 90 100 1.4 1.2 1.0 Relative absorbance (260 nm) Temperature (C) Pneumococcus (38%) G+C E. coli (52%) S. Marcescens (58%) M. Phlei (66%) 阳离子中和核酸的负电荷而使 Tm 增大 60 70 80 90 100 110 100 80 60 40 20 0 Tm (C) G + C (%) 0.15 M NaCl 0.015 M Na citrate 0.01 M phosphate 0.001 M EDTA 3’ 5’ 5’ 3’ 4、核酸的复性 变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复性后，一系列物理、化学性质将得到恢复。DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。 将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性，这一过程也叫退火（annealing)。分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。 复性反应的速度用Cot1/2表示。Co为变性DNA复性时的浓度，t为时间，以秒表示。（P352） DNA复性 影响复性的因素：单链片断浓度愈高，复性速度愈快；片断愈小，链间错配频率低，复性较快；片断内的重复序列越多，则容易形成互补区，复性愈快；维持溶液一定的离子强度，消除磷酸基负电荷造成的斥力，可加快复性速度。 （四)分子杂交 在退火条件下,不同来源的DNA互补区形成双链,或DNA单链和RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程称分子杂交. 核酸杂交可以在液相或固相上进行。目前实验室中应用较多较广泛的是用硝酸纤维素膜做支持物进行的杂交。英国的分子生物学家E.M.Southern所发明的Southern印迹法就是将凝胶上的DNA片断转移到硝酸纤维素膜上后,再进行杂交的。 这里以DNA-DNA杂交为例，较详细地介绍Southern印迹法：将DNA样品经限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶进行电泳分离，然后将胶浸泡在碱如氢氧化钠中使DNA变性，将变性后的DNA转移到硝酸纤维素膜上（硝酸