1.PCR引物设计.ppt

第一讲PCR引物设计 原则和计算机辅助工具 PCR引物设计的重要性 我们用得较多的引物设计软件有： Oligo 6.0 ( demo version) Primer premier 4.11 (www．P demo version) 引物设计原则 长度 顺序 碱基组成 二级结构 对3’-端的 要求 对5’-端的 要求 Tm值 PCR引物的寡核苷酸数（长度） 一般在16～30个核苷酸（NT） 至少为16个核苷酸 最好为20～24个核苷酸 以上指与模板链完全配对的碱基数 引物顺序 应是所要扩增基因特异的顺序 若要进行个体间的比较，应选 择保守同一的顺序来设计引物 设计后用电脑DNA数据库检测 同源性 引物的碱基组成 GC为40～60％ ATGC最好随机分布 引物中的二级结构 一对引物的顺序不应自身互补 特别要避免3’-端的重叠，以免形成二聚体等特异的扩增条带 对3’-端的要求 3’-端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格配对 若3’端最末的碱基不肯定，可用次黄嘌呤核苷取代的引物，因为 I 可与ATGC配对，这样可避免因末端碱基不配对而造成PCR失败 对5’-端的要求 5’-端可附加一段与模板非互补的序列，可长至45NT，而不影响扩增，这点对研究基因结构与功能很有用。 一般在引物的5’-端可加入限制酶位点序列，以便进行克隆。在酶切位点5’-端还应加上适当数量的保护碱基极（如GCGC和GGCC），以保证扩增反应产物克隆后能够被酶切。 RE位点5’-端应加入的保护碱基 功能基因起始密码（ATG）5’-端前应加入的序列（Kazok序列） 动物功能基因前加入序列 CCACCATG 引物的Tm值 Oligo 6.0分析后的PCR报告 ------------------------------------------------------------ PCR Optimal Annealing Temperature: 62.5 ℃(Max: 72.0 ℃) ------------------------------------------------------------ Position Length Tm [℃] GC [%] P.E.# ------------------------------------------------------------ Product ----- 1669 92.1 61.2 61.2 Upper Primer 1 24 76.7 58.3 536/537 Lower Primer 1647 23 80.3 65.2 538/538 -------------------------------------------------------------- Product Tm - Upper Primer Tm: 15.5 Primers Tm difference: 3.6 简并引物的设计 一般应用于： 从蛋白到核酸分子的研究 用一对引物扩增一类分子 首先分析保守区 注意的原则 第二讲PCR常见问题分析与对策 PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 : PCR反应的关键环节有: ①模板核酸的制备， ②引物的质量与特异性， ③酶的质量及， ④PCR循环条件。 寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板： ①模板中含有杂蛋白质， ②模板中含有Taq酶抑制剂， ③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白， ④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。 ⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液， 其程序亦应 固定不宜随意更改。 酶失活： 需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶 或胶中未加溴乙锭。 引物： 除了引物设计方面的问题 ，引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为： ①选定一个好的引物合成单 位。 ②检查引物，引物的浓度不仅要看OD值，更