[工学]广谱抑菌乳酸菌筛选.ppt

* * 具广谱抑菌活性乳酸菌的筛选 主讲人：杜冠华 食品一班 2组 小组成员：刘紫萱、谭阔、向玉宇、杜冠华、张普娟、闫佳佳 乳酸菌细菌素是乳酸菌在代谢过程中合成的 具有抑菌活性的多肽或蛋白质复合物。因为具有安全、无毒副作用和无抗药性等优点，引起了广大食品防腐剂、饲料添加剂以及医药开发人员的极大关注，成为国内外的研究热点。 乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳 性细菌的总称。普通的乳酸菌，活力极弱，它们只能在相对受限 制的环境中存活，一但脱离这些环境，其自身也会遭到灭亡。只 有经过特殊工艺处理的乳酸菌才能到达肠道。进入肠内的乳酸菌， 必须具备数量多、活力强，才能发挥其生物功效。如何研制出高 浓度且活力强的乳酸菌，成为了当今微生学家们追求的梦想。 1.实验材料： 1.1 供试材料 酸奶、泡菜、发酵肠 1.2 指示菌 大肠杆菌( Escherichia coli)、 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、曲霉、酵母菌，均保存于本院微生物实验室。 1.3 培养基 MRS 固体培养基、 MRS 液体培养基（现成） PDA 培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g， 蒸馏水1000 ml LB 培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g， NaCl 10 g，蒸馏水1000 ml， pH 7.0 半固体培养基(上层培养基)：配方同上，琼脂含量为0.6 %。 固体培养基(下层培养基)：配方同上，琼脂含量为2 %。 以上培养基使用前需先121 ℃高压蒸汽灭菌15~20min。 2. 实验方法 2.1 乳酸菌的分离筛选 取样品于无菌工作台，酸奶（瓶装、袋装、盒 装和老酸奶）取原液及10-1稀释液 泡菜原液及10-1稀释液 发酵肠（四种）剪碎研钵研磨预处理，生理盐 水稀释10-1，均质器拍打（10次/s，90s),采用倾倒平板 法（MRS固体培养基加1.5%~2%CaCO3） 培养； 37oC静置培养48h。 观察溶钙圈：酸奶中乳酸菌数量极少，超市售发酵肠乳酸菌少，泡菜中乳酸菌数量几乎没有，市场售发酵肠乳酸菌较多 2.2 乳酸菌发酵液制备 用接种环挑取分离活化的乳酸菌单菌落32株接种于装有MRS 液体培养基6 ml 的无菌试管中，37 ℃静置培养24 h，10000 r/min 离心10 min，上清液待用。 2.3 指示菌菌悬液的制备 指示菌中的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌接种于装有LB 液体培养基的锥形瓶中，37 ℃摇床培养16 h~18 h；曲霉、酵母菌接种于PDA 液体培养基上，28 ℃霉菌摇床培养48 h，酵母菌静置培养48 h。(时间) 2.4 初筛方法 采用牛津杯法做抑菌实验（其中一部分采用滤纸片）。 先将熔化并冷却至45 ℃的灭菌LB固体培养基放入37 ℃水浴锅中中，保温待用；取上述LB固体培养基倒平板作底层培养基，取200 μL 指示菌发酵液加到装有4 mL 冷却至45 ℃半固体培养基的试管中摇匀，并迅速倒在底层培养基上，制成双层培养基；在每个平板上均匀放置4 个灭菌牛津杯，取待测菌发酵液100 μL 无菌加在牛津杯里，37 ℃培养箱中静置培养, 观察抑菌情况, 选取牛津杯周围有明显抑菌圈的菌株作进一步试验。 倾倒平板41个，其中接种大肠杆菌12个，金黄色葡萄球菌13个，曲霉，酵母菌的培养皿各8个，将上述待测菌发酵液编号（1.2.3…）并分别接种于相应的牛津杯中。 … - 1.40 32 - 1.55 16 - 1.20 31 - 1.65 15 - 1.10 30 - 1.55 14 - 1.10 29 - 1.75 13 - - 28 - - 12 - 1.50 27 - 1.65 11 - 1.65 26 - 1.50 10 - - 25 - 1.65 9 1.15 1.55 24 - - 8 1.10 1.50 23 - - 7 1.05 1.40 22 - 1.60 6 1.15 1.55 21 - - 5 - - 20 - 1.75 4 - 1.10 19 1.00 1.35 3 - - 18 - 1.55 2 - 1.60 17 1.05 - 1 E.coli S.aureus E.coli S.aureus 编号 观察抑菌圈可得：曲霉和酵母菌无明显现象， 对大肠杆菌（G-）和金黄色葡萄球菌（G+） 的抑菌作用如下表所示： 的有3,21,22,23,24号这五株菌 金黄色葡萄球菌抑制作用较强通过观察，同时对大肠杆菌和 表一 单位：cm 3 .结果与分析 3.3.1 排除有机酸的干扰 乳酸菌发酵液对指示菌的抑制作用可能是代