第十一章 外源基因的表达.pptVIP

第十一章 目的基因的表达 一 大肠杆菌表达系统 1 启动子的强度 2 外源基因中密码子的使用 tRNA丰富的密码子，正确的氨基酸会很快连接上；而tRNA稀少的密码子，要经过多次相互辨认才能找到正确的tRNA 表达效率往往不高，应针对密码子的偏爱性采取措施 3 mRNA的稳定性和翻译起始的效率 4 载体的选择 重组质粒有较高拷贝数且表达量高。 适用范围广。 稳定性高。 表达产物容易纯化。 带纯化标签的表达载体 6个组氨酸(His)的核苷酸置于待表达基因的N端，个别情况下置于待表达基因的C端 可以通过金属螯合亲和层析一步分离纯化 5 宿主菌的培养控制 质粒稳定性与拷贝数的控制 重组大肠杆菌培养方式 二 酵母表达系统 酵母基因表达系统宿主菌 * * 基因工程技术的核心是基因表达技术。 基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物——蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。 大肠杆菌由于遗传背景简单，可进行大规模发酵培养，表达周期短，操作简单及已有大量可供选择利用的载体，而成为人们克隆与表达外源基因的首选。 但在外源基因的表达过程中，常常会遇到表达效率不高和产率较低等困难。以往的研究表明，影响外源基因表达效率的因素主要有密码子的选用、目的基因的量、载体的选择、宿主菌的培养控制等。 大肠杆菌基因表达载体 原核生物启动子 诱导型启动子： 组成型启动子： 启动子的分离 聚合酶保护法 PCR扩增法 选择RNase缺失的受体菌 6 蛋白质的翻译系统 在原核生物中影响翻译起始的因素有：起始密码子、核糖体结合位点（SD序列）、起始密码子于SD序列之间的距离和碱基组成、mRNA的二级结构、mRNA上游的5′端非翻译序列和蛋白编码区的5′端序列等。 蛋白质的翻译系统 核糖体结合位点（SD序列） 翻译起始密码子 翻译终止密码子 外源基因在大肠杆菌表达的形式 包涵体蛋白 包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。 包涵体存在部位：细胞质、细胞周质 包涵体的组成 蛋白质 非蛋白质 外源基因的表达产物：占大部分，具有正确的氨基酸序列，但空间构相错误，因而包涵体蛋白一般没有生物学活性。 受体细胞本身的表达产物：如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白等。 包括DNA、RNA和脂多糖等。 包涵体形成的本质——是细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括三个方面： ①折叠状态的蛋白质的聚集作用； ②非折叠状态的蛋白质的聚集作用； ③蛋白质折叠中间体的作用。 融合蛋白 融合蛋白——将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。 *融合蛋白与单独表达的外源蛋白相比具有以下优点： ①稳定性好； ②表达效率高； ③较易于分离纯化。 宿主菌 常用的宿主菌 枯草芽孢杆菌 短小芽孢杆菌 地衣芽孢杆菌 酵母菌的特点： 基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便，并于1996年完成了对酿酒酵母基因组全序列的测定； 具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后加工和修饰系统； 可将外源基因表达产物分泌到培养基中； 对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒； 可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。 主要包括 酿酒酵母* 巴斯德毕赤酵母 乳酸克努维酵母 多型汉森酵母 酿酒酵母 它具有作为宿主菌必须具备的许多条件，是最早应用于外源基因克隆和表达的酵母菌。目前已表达了诸如乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子等多种外源基因产物。其缺点是在发酵过程中会产生乙醇，影响酵母的生长代谢和基因产物的表达。此外，酿酒酵母在蛋白质的加工过程中会发生过度糖基化作用，其分泌表达能力也有待提高。 巴斯德毕赤酵母 它是一种甲醇营养菌，甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶基因的高效表达，如乙醇氧化酶基因（AOX1）的表达产物可在细胞中高水平积累。 在毕赤酵母中得到表达的重组异源蛋白有乙型肝炎表面抗原、人肿瘤坏死因子、人表皮生长因子等几十种。毕赤酵母的分泌表达能力比酿酒酵母强，但对其遗传背景了解还比较少，且发酵周期也比较长。 乳酸克努维酵母 该酵母的遗传背景比较清楚，工业上用来发酵生产β-半乳糖苷酶。 某些质粒载体可在该酵母中稳定的保存下来，不容易丢失。 该酵母可表达分泌型和非分泌型重组异源蛋白，其表达水平和效果高于酿酒酵母。在分泌表达过程中，能形成正确的蛋白构象，因而利用其表达高等哺乳动物蛋白具有一定的优越性。 目前已有多种外源蛋白在该酵母系统中得到表达，如人白细胞介素-1和β-牛凝乳酶等。 * * * *