中国药科大学-高效液相色谱法(胡育筑).ppt

HPLC对流动相的基本要求： ①不与固定相发生化学反应； ②对样品有适宜的溶解度，要求k在1～10（可用范围） 或2～5（最佳范围）。k值太小，不利于分离； k值太大，可能使样品在流动相中沉淀； ③粘度小。小则柱阻小、柱压低、组分的扩散系数大，能提高柱效。例如用甲醇（0.6厘泊）而不用乙醇(1.2厘泊)； ④必须与检测器相适应。例如用紫外检测器时，不能选用截止波长大于检测波长的溶剂。 流动相组成 梯度洗脱的优点： ①缩短分析周期； ②提高分离效果； ③改善峰形，很少拖尾； ④增加检测灵敏度（因峰变瘦、变高）。 缺点： 有时引起基线漂移、重复性较差 一、输液泵 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 泵： 恒压泵 恒流泵:柱塞往复泵 检测器 紫外检测器 荧光检测器 蒸发光散射检测器 质谱检测器 其它检测器 ⑴电化学检测器 ⑵示差折光检测器 ⑶化学发光检测器 常用紫外检测器的类型可分为三种：固定波长型、可变波长型及二极管阵列检测器。固定波长检测器是光源波长固定的光度计，波长大多为254nm. 可变波长型检测器相当于一台紫外分光光度计，波长可按需要选择。 光电二极管阵列检测器（photodiode array detector；DAD或PAD）。 蒸发光散射检测器 （evaporative light scattering detector; ELSD） 上世纪90年代出现的新型通用型检测器。 理论上这种检测器可用于挥发性低于流动相的任何样品组分的检测， 对于有紫外吸收的组分的检测灵敏度较低 主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸及甾体类等化合物。 7. 定性定量分析方法 7.1 定性分析方法 ⑴色谱鉴定法 ⑵ 化学鉴定法 ⑶ 色谱-光谱联用鉴定法 非在线色谱光谱联用法 色谱-光谱联用仪 7.2 定量分析方法 ⑴外标法 应用较为广泛⑵内标法 内标法分为工作曲线法、内标一点法、内标二点法、内标对比法及校正因子法等，在HPLC中最常用内标对比法。 内标对比法 这种方法不需知校正因子又具有内标法的定量准确度与进样量无关的特点，方法简便实用。在药物分析中分析结果（含量）常用标示量％表示： (Ai/As)样品 （ms)样品 W 标示量% ＝ ──────×────×──×100% (Ai/As)对照 (ms)对照 m 式中(ms)样品与(ms)对照分别是内标物在试样溶液及对照溶液中的量; W为平均片重(或丸重等); m 是取样量. 本章基本要求  掌握Van Deemter方程式及分离方程式的物理意义及对HPLC分离条件选择的指引；掌握反相键合相色谱法(含离子对色谱法及离子抑制色谱法)的分离机理与应用及常用反相化学键合相；掌握吸附色谱法；掌握HPLC的常用定量分析方法。 熟悉离子交换色谱法、空间排阻色谱法、手性色谱法及其他各类高效液相色谱法的分离机理及其应用；熟悉高效液相色谱法色谱条件及溶剂系统选择的原则。 了解高效液相色谱仪的部件和原理。 定性定量分析方法及应用 流动相按组成不同可分为单组分和多组分； 按极性可分为极性、弱极性、非极性； 按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。 两种洗脱方式的比较 （a） 梯度洗脱； （b） 等度洗脱 峰的鉴别 1．苯；2．氯苯； 3．对二氯苯 4．1，2，3三氯苯；5．1，3，5三氯苯；6．1，2，4三氯苯；7．1，2，3，4四氯苯；8．1，2，4，5四氯苯； 9．五氯苯； 10.六氯苯。 HPLC 概述 1 基本原理 2 各类高效液相色谱法 3 固定相 4 流动相 5 高效液相色谱仪 6 6、高效液相色谱仪 输液泵 进样器 色谱柱 检测器 工作站 高效液相色谱仪 HPLC 6、高效液相色谱仪 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 色谱柱：由柱管(不锈钢管)和固定相组成 分析柱 φ 2-4.6mm L 10-25cm 常量柱 φ 1-1.5mm L 10-20cm 常微量柱 制备柱 φ 20-50mm L 3-25cm 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 进样装置 —— 六通阀 紫外检测器（UV）： 最小检测量1