中国药科大学生物制药工艺学课件 05固相析出分离法.ppt

第五章 固相析出分离法;通过改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术。 盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 结晶法;第一节 盐析法 (salt precipitation);两种现象： 盐溶：低盐情况，盐离子强度的增高，蛋白质溶解度增大 盐析：高盐，盐离子强度增加，蛋白质溶解度减小;一、基本原理;原理;在盐析区，符合公式;?、 KS;（一）、无机盐的种类 盐析能力：半径小的高价离子在盐析时的作用较强，阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以高价阴离子更为明显。 PO4 3-＞SO42―＞CH3COO―＞Cl―＞NO3―＞I― NH4+＞K+＞Na+＞Li+ 盐析用盐要考虑几个因素：常用硫酸铵;(二）溶质（蛋白质等）种类的影响;盐析分布曲线;（三）蛋白质浓度的影响;（四）温度的影响;（五）pH的影响;三、盐析操作 ;;（二）盐析方法和注意事项 ;分部盐析法;反抽提法(RNA聚合酶);注意事项;第二节 有机溶剂沉淀(Organic Solvent Precipitation) ;1、降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 2、水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。 ;一些溶剂的介电常数 ;优点： 乙醇等有机溶剂易除去，产品更纯净；密度差较大，离心收集。 缺点： 容易使蛋白质变性，操作常需低温，成本高，需防火防爆。 ;二、影响沉淀效果的因素 ;（三）温度（低温沉淀） 有机溶剂存在下，大多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著地减小。 （四）无机盐的含量 低盐：有利于沉淀，还有保护蛋白质，防止变性。 高盐：增大蛋白质在有机溶剂―水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夹带盐。 ; 多价阳离子，如Ca2+、Zn2+能与蛋白质结合形成复合物，使蛋白质溶解度降低。 胰岛素精制： ;（六）样品浓度;第三节 其它沉淀方法 ;胰岛素纯化： 胰岛素 pH8 除去碱性杂蛋白 pH3 除去酸性杂蛋白 ;金属离子沉淀：与生物分子的酸性功能团作用的??属复合盐法； 有机酸类复合盐沉淀:与生物分子的碱性功能团作用的有机酸复合盐法（如苦味酸盐、苦酮酸盐、丹宁酸盐等）。; 1．金属离子沉淀： Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等； 2．生成有机酸类复合盐沉淀 （1）丹宁即鞣酸 （2）雷凡诺 （3）三氯乙酸（TCA）;雷凡诺 ;猪心提取液 洗脱液 上清液 上清 细胞色素C 沉淀（去除）;三、亲和沉淀 ; ;四、高分子聚合物沉淀 水溶性非离子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使蛋白质水合作用减弱而发生沉淀。 五、表面活性剂 十六烷基三甲基季胺溴化物（CTAB） 十六烷基氯化吡啶（CPC）;*;六、选择性变性沉淀法;固相析出分离法;第四节 结晶(crystallization) ;一、结晶过程;结晶包括三个过程：;浓度温度图;二、过饱和溶液的形成(结晶方法);温度诱导法;盐析结晶法;透析结晶法;（六）、等电点法 （七）、微量扩散法 （八）、化学反应结晶法 调节溶液的pH或向溶液中加入反应剂，生成新物质，结晶析出。 （九）、共沸蒸馏结晶 ;等电点法;化学反应结晶法;综合利用;三、提高晶体质量的途径 ;晶种;（二）、晶体形状 改变晶体外形，可用:选择不同的溶剂、控制过饱和度、结晶温度、调节溶液的pH和有目的地加入某种能改变晶形的杂质等。 （三）、晶体纯度 晶体表面具有一定的物理吸附能力。 重结晶：即将晶体用合适的溶剂溶解再次结晶。;重结晶(recrystallization);红霉素重结晶