[工程科技]第六章酶分子修饰.ppt

6.6 酶分子的物理修饰 通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。 特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。 6.7修饰酶的性质特征 1 热稳定性 许多修饰剂分子存在多个活性反应基团，因此常常可与酶形成多点交联，相对固定酶的分子构象，增强酶的热稳定性。 2 抗各类失活因子 3 抗原性 PEG和人血清白蛋白在消除酶抗原性上效果明显。 4 体内半衰期 许多酶经过化学修饰后，由于增强了抗蛋白水解酶、抗抑制剂和抗失活因子的能力以及对热稳定性的提高，体内半衰期都比天然酶延长，这对提高药用酶的疗效具有很重要的意义。 5 最适pH 6 酶学性质的变化 绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度Vm没有变化。但有些酶在修仰后，米氏常数Km会增大。可能主要是交联于酶上的大分子修饰剂所产生的空间障碍影响了底物对酶的接近和结合。但修饰酶抵抗各种失活因子的能力增强和体内半衰期的延长，能够弥补Km增大的缺陷，不影响修饰酶的应用价值。 6.8 化学修饰实例 右旋糖苷及PEG-2 对大肠杆菌L 2天冬酰胺酶的化学修饰 许多正常组织可大量合成L 2天冬酰胺用于蛋白质的合成。某些肿瘤组织, 包括儿童淋巴母细胞瘤细胞, 都需要外源的天冬酰胺, L 2天冬酰胺酶可催化天冬酰胺水解为天冬氨酸和氨。阻断这些恶性细胞从细胞外液中获得天冬酰胺, 从而造成蛋白合成的停止和细胞的死亡 天冬酰胺酶2氨甲喋呤或阿糖胞苷对急性淋巴母细胞瘤患者有显著疗效, 优点 与其它抗肿瘤药相比, L 2天冬酰胺酶对骨髓的作用较小且不伤害口腔和肠粘膜及毛囊,更适于临床上的肿瘤治疗。 问题 由于天冬酰胺酶对人来说是一种外源蛋白, 所以会产生免疫学副作用, 这种副作用轻的表现为一般致敏反应, 严重的可导致过敏性休克。 修饰的意义 用PEG (聚乙二醇) 或右旋糖苷修饰天冬酰胺酶, 其重要价值在于: 1) 减少免疫原性; 2) 延长清除时间; 3) 改善抗肿瘤活性; 4) 保持酶活性。 　修饰的天冬酰胺酶理化特性研究 1 最适pH 及最适反应温度 修饰的天冬酶胺酶显示了与天然酶相同的最适pH 及最适反应温度 , 它的最适pH为7-10 且其pH 稳定曲线与依赖于pH 的活力曲线相同, 最适反应温度为50℃, 若温度高于65℃或低于40℃, 则其活力显著降低。 2　底物专一性 动力学研究表明, 修饰的天冬酰胺酶对底物L 2天冬酰胺的表观米氏常数与天然酶相同, (Km = 7×10- 6M ) , 天然酶对谷氨酰胺的催化活性很低。修饰酶也同样保留了很高的底物专一性。 3　稳定性 无论是天然酶还是修饰酶, 在45℃以下都较稳定。修饰的天冬酶胺酶的抗蛋白酶水解能力较天然酶有所提高 , 相同反应条件下, 天然酶的活力损失巨大, 而修饰酶能保持约90% 酶活, 这可能是因为对赖氨酸残基的修饰减少了胰蛋白酶的作用位点, 故修饰酶与天然酶相比更不易受损伤, 更适于临床应用。 4　生理学特性 半衰期 以右旋糖苷修饰的天冬酰胺酶大大延长了血浆半衰期, 兔体试验表明, 大肠杆菌天冬酰胺酶的半衰期只有8～ 11h, 如果与40Kd或更大的右旋糖苷结合, 其半衰期将延长6倍]; 体外试验也同样表明化学修饰使半衰期得以延长, 其原因有二: 一是由于修饰酶分子量增大, 二是抗蛋白酶水解能力增强,所以在吸收和代谢过程中速度都明显变慢,因而半衰期延长。 　抗原性 目前已进行的试验表明以40Kd 的右旋糖苷修饰的天冬酰胺酶, 尤其当右旋糖苷以交联方式结合于蛋白质表面时, 免疫原性大为降低。 小节 酶的修饰是在体外对酶进行改造 修饰的目的是克服酶的弱点,以更适合我们的需求. 第六章:酶分子修饰 6.1 引言 生命的自我调节 结构---?功能 定义 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。 酶分子修饰的意义 提高酶的活力 activity 增强酶的稳定性 stability 降低或消除酶的抗原性 immunological property 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响 structure 常用修饰技术 酶分子的主链修饰 酶分子的侧链基团修饰 酶分子的组成单位置换修饰 酶分子的金属离子转换修饰 酶分子的物理修饰 6.2酶分子的主链修饰 利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。 意义： 提高酶活性 降低或消除抗原性 知道酶活性中心位置 一、切断修饰 切断：无功能-?探测活性中心