传代和染色实验报告.docVIP

实验五、Hela细胞传代培养及观察实验六、Hela细胞的H·E染色及观察 实验目的 了解细胞传代培养的方法步骤，学习H.E染色。 实验原理 培养的组织细胞根据细胞类型和供体年龄，有不同的传代能力。传代指将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶，传代培养指当原代细胞增殖到一定密度后的培养，从开始传代后的细胞统称细胞系。 H.E染色指苏木精-伊红染色，染色后细胞核呈深蓝色，细胞质中不同成分呈不同深浅的粉红色。 实验材料 细胞传代：Hela细胞系，PBS溶液，DMEM培养基，双抗（100X，青霉素10000U/mL、链霉素10000ug/mL），消化液：0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液 H.E染色： a. 4%甲醛-PBS溶液 b. 苏木精染液 苏木精0.5g10mL 硫酸铝钾25g，蒸馏水150mL 完全溶解后，混合均匀，加热煮沸3－5min，加入蒸馏水至500mL，最后加入0.1g碘酸钠 c. 盐酸酒精溶液：0.5mL盐酸、100mL 70%乙醇 d. 淡氨水：0.5mL氨水、100mL自来水 e. 伊红染液：0.5g伊红B、100mL80%乙醇 实验步骤 细胞传代 镜检，观察并记录细胞状态 吸弃培养基，加入1mL PBS溶液洗去残余培养基 向培养皿内滴加200uL消化液，37oC消化5 min 吸出消化液，加500uL含10％血清的DMEM培养基 按比例分盘，三分之一留原盘做H.E染色，三分之二换盘做凋亡诱导，每盘均补加培养基至1.5mL 37oC、5％CO2培养 H.E染色 镜检：观察并记录细胞状态 吸弃培养基，以PBS溶液（1mL）漂洗2次 以固定剂固定15分钟 吸弃固定剂，以蒸馏水洗 加入苏木精染液（1mL，可重复使用）染色15分钟 以流动的自来水洗15分钟 加入0.5%盐酸酒精溶液进行分色（数秒） 以蒸馏水洗 以流动的自来水洗3分钟 加入0.5%氨水溶液进行返蓝处理（数十秒） 以流动的自来水洗后观察，效果好则以蒸馏水稍洗 加入伊红染液染色（数秒） 以蒸馏水洗 观察,效果不好，用酒精洗去染液，重复5~13步。得到结果并拍照。 实验结果与分析 细胞传代观察： 消化液处理前：细胞呈不规则，形状多样，贴壁生长，细胞与细胞挤在一起，贴壁数达约70%，细胞核质分界可见，可以看到核内有折光度很低的深色核仁。 消化液处理后：大部分细胞变圆，还是挤在一起，菱角不再分明，有少数细胞已经浮起。 吹吸后：大部分细胞呈圆形浮起，晃动小皿时随水流运动，细胞大小基本一致。 H.E染色观察 镜检：细胞大部分贴壁，约30%，贴壁细胞形状多不规则，在显微镜下可以观察到核质分界，也有圆形的贴壁细胞，那是正在分裂的细胞；有少量悬浮的圆形细胞。 固定：细胞形态保持完好 苏木精染色：细胞被染成蓝紫色，细胞核颜色深，核内染色也有一定的层次感，如一些异染色质染色会比较深，核仁染色也会比较深；胞质颜色浅，较均一。 流动自来水洗：染色稍浅，核质分界还是比较明显 分色：这一步我分色过了，结果核和质的颜色都变得很浅，直接导致后来的失败。 自来水洗：核和质之间有一道白色的分界，核比质稍深 返蓝：核和质的对比更弱了。 伊红染色：核质可以看出分界但是不够明显，主题颜色为粉红 酒精脱色：颜色挥发至染色前，较透明，稍黄。 苏木精染色：这次染得比第一次深，细胞核几乎全部染成蓝紫色 流动自来水洗：染色稍浅，核质分明，核染色深，不好分辨其中的不同成分。 分色：颜色分层，可以看到核内有不同深浅的染色，胞质染色进一步变浅 自来水洗：没有太大变化 返蓝：染色有一点变蓝 自来水洗：没有太大变化 伊红染色：染了三次：第一次：稀释后滴加，洗得过快，几乎没有染上色；第二次：还是太快了，染色很浅；第三次：染了约3秒，可见胞质染红，核质分界明显 拍照：此时由于排队太久，伊红颜色已经几乎完全洗去，而且多次处理使细胞受到伤害，有的细胞形态发生改变，细胞边缘没有那么光滑，多次醇类处理使细胞壁有一定的破损。但还是可以看到比较完好的细胞，胞质为粉紫色，核为蓝紫色。 H.E.染色图片及分析，见下图： 由图可见，细胞大都贴壁，形状不规则。染色结果不是特别理想，可以看出伊红的颜色几乎全部被洗掉了，因为等待照相的时间太长了，这也说明了伊红是一种亲和性比较弱的染料。图片中的细胞细胞膜界限不是很清楚，原因可能有两点，一是染料被洗掉了，所以不清楚；另一种可能是，多次用含醇的溶液处理，对细胞膜产生了一定的损伤，所以细胞膜有稍微裂解，细胞形态发生了变化。这和染色的要求是相悖的，好的染色应该在染色前后细胞形态不发生改变。所以可以考虑换用一些对细胞膜伤害不那么大且亲和性较强的染料，比如一些水溶性的强亲和性染料。由于这是课堂实验，除了考虑染色效果外，还不得