《现代分子生物学》第十讲 分子 ....ppt

第十讲 分子生物学研究方法 (五)功能基因组学研究 本章主要内容： 1、RNA干扰技术及应用； 2、基因敲除技术及应用。 一、RNA干扰技术 RNAi广泛存在于自然界 随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。 这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。 随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。 何为siRNAs 越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs）来抑制特定的哺乳动物基因表达。 siRNA即为能够以同源互补序列的mRNA为靶目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片断双链RNA分子。 如何设计有效的siRNA一直是当前RNAi研究的热点话题，不同的实验室有不同的结果。 体外实验结果的提示 体外实验表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21-23核苷酸长的RNA片段，后者会使目的mRNA被切割为21-23核苷酸长的片段。 从已经发生RNAi的果蝇S2细胞中，Hammond等人部分纯化了一种核酸酶，该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。 那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNA该降解而哪些不该呢？ 由于在纯化该核酸酶时，可以共分离出21-23核苷酸长的dsRNA片段，这暗示该核酸酶对mRNA的切割有可能是以这些片段作模板指导进行的。根据以上的实验结果，人们提出一种RNAi作用的简单模型。 RNAi作用的简单模型 当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA。 识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。 核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。 通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到RDE-2,RDE-3和Mut-7等RNAi相关的基因。 RNAi研究的一般技术路线 一般设计原则 （1）从mRNA 的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。 （2）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST. （3）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。 负对照 一个完整的siRNA实验应该有负对照。 作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。 通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。 3、制备siRNAs的方法 尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的——研究人员几乎不需要做什么工作。许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。 主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。 由于价格比其他方法高，为一个基因合成3-4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。 最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究； 不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素。 体外转录 相对化学合成法而言成本比较低，是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。 更重要的是能够更快的得到siRNAs。 值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。 不足之处：实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。 最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。 不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA；长期研究。 用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA 其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。 这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒”?就可以避免这个缺陷。