[教育]3-分子荧光-new1.ppt

在医学检验、药物分析、生物化学、毒性分析中的应用 荧光探针法测定蛋白质 原理： Mn+ 与含有－OH或C＝O的有机染料(发荧光的分子)相遇时，氧原子中的弧对电子可顺利地进入杂化轨道，形成稳定的配合物。在酸性条件下，该体系遇到结构不对称的蛋白质分子时，互相极化产生静电作用而生成新的大分子，改变了原体系的光谱性能，从而能定量测定蛋白质的含量。 为增大染料和蛋白质的溶解度，常加入表面活性剂。 如Ti(iv)-4,5-二溴苯基荧光酮-Tween-80与蛋白质的显色反应可测定尿中蛋白，尿液中其它成分不干扰。 * * 主要内容 荧光的产生 荧光效率与化学结构的关系 荧光光度法的定量依据 荧光光度计 应用 第3章 分子荧光分析法 §1 荧光的产生 荧 光: 以辐射驰豫的形式回到基态时的发射光 在分子荧光分析中，常以紫外光及可见光区的辐射作为激发能，所产生的荧光则多在可见光区 问题： 分子荧光光谱是连续光谱吗? （二）激发光谱曲线和荧光光谱曲线 荧光为光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，可根据它们的激发光谱曲线来确定。 固定测量波长为荧光最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制 激发光谱曲线 激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同，但激发光谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则是吸光度与波长的关系曲线，两者在性质上是不同的 固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同的波长时所发射的荧光或磷光强度，即可绘制荧光或磷光光谱曲线 1. 荧光发射光谱的形状与激发波长无关 由于较高激发态通过内转换及转动弛豫回到第一电子激发态的几率较高,远大于由高能激发态直接发射光子的速度，故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐射激发，电子都从第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能层 2. Stokes位移---分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长 受激分子通过振动弛豫而失去转动能; or 溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。 荧光发射光谱的特性 3. 镜像规则 通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系 . 作业：为什么荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系?? 你是如何理解的? 3.镜像规则 通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系 . why? 吸收光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能层形成的。其形状决定于第一电子激发态中各 振动能层的分布 荧光光谱是激发分子从第一电子激发态的最低振动能层回到基态中各不同能层形成的。所以荧光光谱的形状决定于基态中各振动能层的分布情况。 基态中振动能层的分布和第一电子激发态中振动能层的分布情况是类似的。 因此荧光光谱的形状和吸收光谱的形状极为相似 Stokes荧光 共振荧光 l激发 = l荧光 §4.2 荧光效率与荧光分子结构的关系 一. 荧光效率 (荧光量子产率) φF越大，化合物的荧光越强。 有分析应用价值的荧光化合物, 其荧光量子产率通常在 0.1～1 之间 φF = 发射的光子数 吸收的光子数 kf kf + Σk ≤ 1 kf ：辐射跃迁的速率常数 Σk：各种非辐射跃迁过程的速率常数之和 = 二. 荧光与有机化合物结构的关系 从分子结构来说,绝大多数能发荧光的物质为含有低能的π→π* 跃迁能级的芳香环或杂环化合物 1. 共轭效应 π电子的共轭程度越大，就越容易被激发,分子的荧光效率越大,而且其最大荧光波长也会相应地“红移”——向长波长方向移动 例：导电性高分子材料 2. 刚性结构和共平面效应 给电子取代基, 产生n-π共轭效应, 加强荧光。 3. 取代基的影响 a.?????? 得电子取代基,会使荧光减弱,如硝基苯无荧光。 4. 金属螯合物的形成 近几年来,发现了8-羟基喹啉铝络合物有一个新的应用:作为小分子发光材料,用于有机电致发光器件中 5. 化学环境对荧光的影响 温度：温度越低，φF越大 溶剂：极性越强，φF越大 pH值的影响 荧光的猝灭 荧光物质的分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用，引起其荧光强度降低，消失或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象 原因： 碰撞 猝灭剂分子与荧光物质发生化学反应 溶解氧的存在 : 氧化荧光物质 自猝灭 : 高浓度时发生(自碰撞失活) §3.3 荧光的定量分析 荧光分析光度法的定量依据 IF ∝ C 荧光物质的荧光强度应正比于其吸收的激发光的光强。即: IF = k