原生质体培养技术.pptVIP

植物原生质体培养技术 2011年4月11日 一、原生质体概念 原生质体（protoplast） 脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球。原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。 亚原生质体（subprotoplast） 在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成的一些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。 二、原生质体培养研究背景 1880年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast)一词。 1902年 Haberlant通过实验就预言:体外培养单个细胞可通过其分裂得到培养组织； 1954年 植物单细胞培养首次获得成功。Muir将培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上而得到了它们的单细胞克隆,并建立了看护培养的方法； 1954年 De Ropp开创了悬滴培养技术； 1960年 Jones等完善悬滴培养技术,并建立了微室培养的方法。 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。 1971年，Takebe et al.首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。 1985年，Fujimura et al.第一例禾谷类作物－水稻原生质体培养再生植株。 1986年，Spangenberg et al.单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。 至今，原生质体培养可形成胚状体并再生植株或芽的种类已经达到367种，分步与46科，160属，其中成功报道最多的是茄科，其次是豆科，禾本科、菊科、十字花科、伞形科、蔷薇科。 三、原生质体培养技术的研究意义 第一，与完整植物细胞相比，原生质体易于摄取外来的物质，如DNA，染色体、病毒、细胞器、细菌，因此可利用其作为理想的受体系统进行各种遗传操作，在植物遗传育种实践方面意义重大。 第二，由于没有细胞壁，有利于进行体细胞诱导融合和单细胞培养。 第三，可用于细胞表面的结构与功能的研究，细胞器结构与功能的研究，病毒侵染与复制机理的研究，以及细胞核与细胞质相互关系，植物生长物质的作用、植物代谢等生理问题的研究。 四、原生质体培养的基本方法 原生质体的培养方法 五、原生质体培养条件 密度：平板培养103~104个/ml,液体培养104~105个/ml。 温度：多数为25~28℃，少数为16~37 ℃。 光照：500lx,18h或2800lx连续光照。多数要求黑暗或弱光。 培养基：常用以B5培养基为基础的KM-P培养基和以MS培养基为基础的N6培养基。 铁皮石斛叶肉原生质体的分离与培养 * * 材料的选择与预处理 原生质体的分离 原生质体的纯化 活力的检测 基因型、材料的类型和生理状态 黑暗培养、低温处理、预质壁分离 机械分离法、酶解分离法 离心沉淀法、漂浮法和界面法 形态识别、活体染色和荧光活体染色 原生质体培养 原生质体的生长发育和细胞壁的再生 植株的再生 愈伤组织或胚状体诱导形成 取石斛嫩叶 切成条状 以1:10的量加入酶液 在黑暗、(27±1)℃,以50 r/min振荡酶解6 h. 过滤、离心 用原生质体培养基洗涤2次. 收集到的原生质体悬浮于含18%蔗糖的CPW盐溶液中静置1 h （无菌条件下，成长状况良好） （1.0~2.0mm） （100目尼龙网）（350 r/min 5min） (若以蔗糖为渗透压调节剂时以600 r/min下离心5 min) 2周后添加4滴甘露醇浓度为0.2 mol/L的新鲜培养基（促细胞壁形成) 将纯化的原生质体稀释 滴入平底培养皿中 (21±0.5)℃、液体浅层培养、 1/10 MS 30d时将细胞团转移至固体培养基中培养. *