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实验一 蛋白质的定量测定? 实验目的： 1.1 掌握紫外法、Folin－酚试剂法（Lowry法）和考马斯亮蓝染色法（Bradford法）测定蛋白质含量的原理和方法 1.2. 掌握分光光度计的原理和使用方法 蛋白质含量测定有许多种方法，如何选择合适的方法主要基于以下五点考虑： ①有多少样品可供分析; ②蛋白质样品浓度大约是多少; ③样品中含有哪些可能影响定量的化学物质； ④所选方法是否简单、可靠； ⑤含量测定的专一性要求是否很高。 2.2常用的方法主要有 ①紫外法；②Folin－酚试剂法（Lowry法）；③考马斯亮蓝染色法（Bradford法）；④凯氏定氮法； ⑤BCA法（二辛可宁酸法）。 每种方法都有一定的灵敏度，被测样品中蛋白含量应控制在其灵敏度范围内。 测定绝对含量应用凯氏定氮法（蛋白质的含氮量为16％）。 考马斯亮蓝染色法（Bradford法）的特点: 1、简便, 灵敏度较高. 且只需要一种反应试剂； 2、影响因素较少. 去污剂和两性物质对测定有 干扰. 3、小于3000Da 的多肽无法测定. 4、蛋白浓度高时非线性. 5、配制的染色液需过滤除去未溶解的考马斯亮蓝G250. 微量移液枪使用注意事项 轻拿轻放，不能摔、砸。 严禁将量程调出标准使用范围。 使用过程中携带有Tip头的移液枪不可以倒过来(特别是里面还有液体的时候)，以防液体流入枪内，腐蚀部件。 不用移液枪时不要一直拿在手里，应挂于枪架上。 每日实验结束后，应将移液枪量程调至最大， 长期压紧弹簧会影响准确度。 5000ul移液枪取液范围： 1000-5000ul 1000ul移液枪取液范围： 200-1000ul 200ul 移液枪取液范围： 40-200ul 40ul 移液枪取液范围： 5-40ul 10ul 移液枪取液范围： 0.5-10ul * 紫色复合物， 吸收值与浓度 呈正比 BCA 蛋白质在紫外光区（190nm-360nm）有两个强烈吸收峰：280nm和190nm。 280nm有吸收的电子所需能量较少，因为这些光子存在于芳香环的共轭双键中，色氨酸(Trp)、和酪氨酸(Tyr)有芳香环，可吸收280nm波长的光子，苯丙氨酸（Phe）、二硫键也有微弱吸收。蛋白质的吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关，因此相同浓度的不同种类蛋白质，其280nm的吸收值差别很大(图1)。 一 紫外法 图1.蛋白质和核酸的紫外吸收光谱 图A是15μg /ml蛋白的吸收光谱。图A中插图是1mg/ml的牛免疫球蛋白IgG(I)、牛血清白蛋白(B)和白明胶(G)的吸收光谱，缓冲液为：0.01% Brij35,0.1M K2SO4,5mM KH2PO4,pH7。 图B是10μg /ml RNA和DNA的吸收光谱。 肽键在190nm有强吸收峰。 一般分光光度计在190nm的光强较弱，且O2在此波长有吸收，因此通常使用205nm或210nm波长，Trp, Phe, Tyr, His, Cys, Met, and Arg的侧链在此波长有吸收。优点：灵敏，较稳定。 缺点: 干扰因素多。许多化学物质特别是含C＝C双键和C＝O双键的物质在此波长范围有吸收，所以必须严格控制反应条件。 一 紫外法 优点： ①不需添加任何试剂，因而对样品没有任何破坏； ②测量极其简单迅速； ③蛋白浓度和吸光度是线性关系，容易计算。 ④适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白质。 一 紫外法 缺点： 1、就是干扰测定的影响因素特别多，尤其是RNA和DNA在此波长均有强吸收, 所以一定要考虑样品中是否有核酸.要得到准确可靠的结果，必须严格控制样品溶液的pH和化学组成，使待测样品和标准样品的实验条件一致。 2、敏感度低，要求样品的浓度较高，量较大。 3、用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，误差较大。 一 紫外法 注意事项： 1.测紫外吸收要用石英比色皿 ！ 2.定量实验取液要准确。 3. 从低浓度到高浓度依次测量，比色皿不要润洗。 因此3ml溶液足够测定。 4.测量完毕，请把光度计的盖打开 ！ 5.如实填写仪器使用记录本。 6.进实验室后签到，做完离开时再签名. 7.每次实验时提交上一次的实验报告. 管号 0 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白溶液（ml） 0 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 0 双蒸水（ml） 4.0 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 0 蛋白质含量(mg/ml) 0 0.25 0.375 0.5 0.625 0.7 1.0 ? 未知蛋白溶液（ml） - - - -