[理化生]DNA的粗提取与鉴定.ppt

* * 专题5 DNA和蛋白质技术 DNA的粗提取与鉴定 一、课题重点与难点 课题重点：DNA的粗提取和鉴定原理方法。 课题难点：DNA的粗提取和鉴定原理方法。 二、基础知识分析 （一）DNA的提取原理 1、DNA的溶解性 　　DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同 问题思考与讨论： 　　①根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下， DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？ 　　当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol／L时，DNA的溶解度最大，浓度为 0．14 mol／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出 　　②如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？ 　　DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离 　2、DNA在酒精溶液中的溶解性 　　3、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 ①蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响 ②大多数蛋白质不能忍受60－80°C的高温，而DNA在80°C以上才会变性 ③洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响 （二）、DNA的鉴定原理 ① DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂 ②甲基绿 （绿色） 三、DNA的粗提取与鉴定的实验设计 （一）实验材料的选取 1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取2～3种实验材料） 2、原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大 动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、动物细胞 讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ ①植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜. 2、植物细胞 讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ 答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解 ②实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液 答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等. 讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ （三）去除滤液中的杂质 讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？ 答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质. 讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？ 答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开； 方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离. （四） DNA的析出与鉴定 DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95 ％） ，静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。 1、DNA的析出 2、 DNA的鉴定 　　鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml 试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色． 案例：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取 三、实验案例 ②鸡血细胞极易吸水胀破 鸡血细胞做实验材料的原因 ? ①鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得 1、准备鸡血细胞液 ①过程： ②柠檬酸钠作用: 讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？ 答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆. 取柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。 防止血液凝固 2、方法步骤 将制备好的鸡血细胞液5 mL～10mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用玻璃棒充分搅拌5 min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。 ①提取鸡血细胞的细胞核物质 讨论： 答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，