鸡血细胞的融合-liu.pptVIP

[目的要求] 1.掌握细胞融合的概念及基本原理。 2.初步掌握PEG诱导细胞融合技术。 3.了解细胞融合技术的生物学和医学意义。 [实验原理] 本实验材料为鸡红细胞，其核结构紧密，易于观察。 [实验用品] 1. 器具：普通光学显微镜、普通离心机、恒温水浴箱、10 ml刻度离心管、试管架、吸管、注射器、载玻片等。 2. 材料：新鲜鸡血或与Alsever液混合的备用鸡血。 3. 试剂：50％PEG（现用现配），Alsever液，0.85％生理盐水，GKN液，Janus green染液或Giemsa染液。 [实验步骤] 1.鸡血的采集与抗凝 将新鲜鸡血与Alsever液按1∶4混成悬液 （抗凝效果最佳），或存放 4℃冰箱保存备用 （3～4天内可用）。 2. 50％PEG溶液的配制 称取适量PEG (Mr 4000) 放入烧杯中，将其加热熔化，待冷却至50℃，加入等体积的已预热至50℃的GKN液并充分混匀，37℃保温备用。PEG溶液需使用前现配。 [作业] 绘制显示所观察到的细胞融合情况图。 [思考题] * * 鸡血细胞的融合实验 PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子 量的多聚体。PEG可与水分子借氢键结合,在高浓度 (50％)的PEG溶液中自由水消失，导致细胞脱水而发 生质膜结构的变化，引起细胞融合。为了发挥PEG促 进细胞融合的效力，必须采用较高浓度的PEG溶液， 但在高浓度PEG溶液下，细胞可能因脱水而受到显著 的破坏。因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间 是PEG融合技术的关键。 3.细胞融合操作 (1)离心洗涤： 取(1:4)鸡血悬液lml加0.85％生理盐水至4m1，混匀。 (重复1次) 加GKN溶液至4ml,混匀。 3000rpm,1min，弃上清 。 3000rpm,1min，弃上清。 去上清,加GKN溶液至0.5m1,混匀。 (2)水浴 缓慢逐滴加0.25ml的50%PEG至悬液,边加边混匀。 39℃ 水浴5min 水浴10min 加入GKN溶液至4m1，混匀。 水浴15min 3000rpm，1min，弃上清 加入GKN溶液至4m1，混匀，3000rpm，1min。 弃去上清液，加入GKN溶液至1ml处，混匀。取 1小滴悬液滴于载玻片上，加入Janus green染液1小滴，用牙签搅匀，8min后盖上盖玻片，观察细胞融合情况。 (3)结果观察: 在显微镜下观察细胞融合情况，可看到不同融合 状态的细胞：两细胞的细胞膜间相互接触、粘 连；接触部位的细胞膜崩解，两细胞间的细胞质 相通，形成细胞质通道；通道扩大，两个细胞连 成一体；细胞合并完成，形成一个含有两个或多 个核的圆形细胞。 2. 计算融合率： 融合率＝视野内发生融合的细胞核总数/视野内所有细胞核总数×100％ [实验结果及分析] [注意事项] 1.滴加50％PEG时，应缓慢、逐滴加入，而且每 加一滴应轻摇离心管以混匀，滴加完毕后可用 滴管温和混匀。 2.高Ca2+浓度能提高细胞的融合率。 3.因PEG对细胞有毒性，应严格控制作用时间于 1～2min，但本实验中融合后的细胞不继续培 养，可将处理时间延长至15min以达到最高融 合率。 1．细胞融合率受哪些因素的影响? 2．在进行细胞融合时，要注意那些问题?