[理化生]第三章 蛋白质的化学-2008.ppt

* * * * * * * * * * * * 1、蛋白质的一级结构的概念 一级结构指多肽链的氨基酸组成、线性顺序、多肽链数目和关联。 多肽链的氨基酸顺序，是蛋白质生物功能的基础。 稳定一级结构的力：肽键、二硫键。 蛋白质空间结构（高级结构、构象）：指蛋白质分子中原子和基团在空间的排列分布和肽链的走向。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * A离子间的盐键，b极性基间的氢键、c非极性基间的相互作用力（疏水键）、d范德华力、e二硫键、f 酯键、 (1)、末端分析 N－末端测定 Sanger法 Edman法 DNS法 氨肽酶法 C－末端测定 肼解法 羧肽酶法 二 蛋白质一级结构的测定 2、二硫键的拆开和肽链的分离 3、肽链的部分水解和肽段的分离 （1）溴化氰裂解 （2）部分酸水解 （3）酶水解（牢记四种酶解方式） 常考察内容 酸碱 CNBr 酶 （1）酸水解 常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸在105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。 此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏； 含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；天门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。 肽链的水解方式 （２）碱水解 一般用5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。 由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。 部分的水解产物发生消旋化。 该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。 （３）部分酸水解 稀酸 　　Asp的羧基端 浓酸 　　羟基氨基酸的氨基端 （４）CNbr裂解 Met的羧基端 专一性好，切点少 （５）酶水解 目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。 应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。 最常见的蛋白水解酶有以下几种： Trypsin ：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快） 碱性氨基酸羧基端 水解位点 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu，蛋氨酸Met和组氨酸His水解稍慢。 芳香氨基酸羧基端 糜蛋白酶 水解位点 Pepsin：R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu水解速度较快。 主要是酸性氨基酸和芳香氨基酸羧酸端 胃蛋白酶 水解位点 thermolysin：R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu，异亮氨酸Ileu,蛋氨酸Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。 嗜热菌蛋白酶 水解位点 4、测定每一段氨基酸顺序(edman降解) 5、由重叠片段推断肽链顺序 6 、确定二硫键位置 确定二硫键位置 (一) 氨基酸的分析 纸层析法:利用极性与非极性氨基酸在水和 有机溶剂中的溶解度不同的特点，在滤 纸上进行分离的方法(分配层析); 柱层析法：根据氨基酸的离子交换反应的原 理，如HPLC; 薄层层析法：利用吸附原理进行层析的方法， 在玻板上的薄层吸附剂上进行。 三 蛋白的鉴定及定量 One-Dimensional 单向层析 Known Sample Y X Rf=X/Y ? Filter-paper Chromatography Two-Dimensional 双向层析 溶剂前沿 Thin-layer Chromatography Thin-layer Thin-layer 1cm HPLC mAU （二） 蛋白质含量的测定 (1) 紫外光吸收法:此法是用紫外吸收分光光度计在紫外光区测定蛋白质的光吸收，从而测定蛋白质含量的方法。 (2) 双缩脲法 在强碱性溶液中，蛋白质与CuSO4反应，生成紫红色化合物，这个反应称为双缩脲反应（biuret reaction)。 在碱性条件下，蛋白质与CuSO4所生成的颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸组成无关。将样品同标准蛋白质同时试验，并于540--560nm波长下侧其光吸收值，通过标准曲线曲线即可求得蛋白质的含量。 此方法简便、迅速，不受蛋白质特异性的影响，但方法的灵敏度较差，所需样品量大（0.2-1.7mg/ml）。 (3)福林一酚试剂法 福林一酚试剂（Folin-phenol reagent ) （酪氨酸），在碱性条件下很容易将磷钼酸和磷钨酸还原为蓝色的钼蓝和钨蓝，所生成蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，因此，在650nm或660nm波长下测定光吸收值，即可测定蛋白质含量。 下课了！ * * 一克氮所代表的蛋白质重量约为6.25克。