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[理学]03核酸性质
BIOCHEMISTRY DNA mRNA protein 第14章 核酸的物理化学性质 一、核酸的水解 酸水解 碱水解 酶水解 mRNA→cDNA 限制性内切酶 在细菌中发现有这类酶,主要是降解外源的DNA。 识别双链DNA上特定的位点(4-8碱基对(bp)范围),将两条链都切断,形成粘末端和平末端。具有极高专一性,数千种。 往往与一种甲基化酶同时成对存在,具有相同的底物专一性,具有识别相同碱基序列的能力。 核酸的呈色反应 溴 化乙锭EtBr: ------核酸染料 在300nm波长的紫外光照射下发出590nm荧光。在适当的下,荧光强度与DNA片段的大小(或数量)成正比。 ★DNA的变性是爆发式的,变性作用发生在一个很窄的温度范围内。 DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度称为解链温度(Tm melting temperature )。 浓度50ug/mL时,双链DNA A260=1.00,完全变性(单链),A260= 1.37。 当A260增加到最大增大值一半时,即1.185时,对应的温度即为Tm。 DNA的Tm一般在82~95℃之间。 影响DNA的Tm值的因素 ①DNA均一性 。 均一性越高,变性的温度范围越窄,据此可分析DNA的均一性 。 ②G-C含量与Tm值成正比。 测定Tm,可推知G-C含量。 G-C%=(Tm-69.3)×2.44 ③介质中离子强度 离子强度高,Tm高。 (二)复性 renaturation 变性DNA在适当(一般低于Tm20~25℃)条件下,两条链重新缔合成双螺旋结构。 ★复性机制:10~20bp成拉链 ★热变性DNA在缓慢冷却时可以复性,快速冷却不能复性。 ★DNA片段越大,复性越慢; ★DNA浓度越大,复性越快。 ★复性速度可用Co·t衡量。 Co为变性DNA原始浓度mol·L-1,t为时间,以秒表示。 复性(renaturation) 高于Tm值5℃ 复性 也称退火 (annealing) Cot : 时的Cot值,即指复性完成一半时的Cot值。 (三) 分子杂交 分子杂交的原理示意图 不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有碱基配对的区域,在复性时可形成局部双螺旋区,称核酸分子杂交(hybridization)。 制备特定的探针(probe)通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。如:southern印迹法 探针:通常对天然或人工合成 的DNA或RNA片段进 行放射性同位素或荧光标记,做成探针。 原位杂交:直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交,因未改核酸所在的位置称。 点杂交:将核酸直接点在膜上,再与探针杂交称。 核酸杂交可以在液相或固相上进行 Southern Blotting DNA样品 → 酶切 → 电泳 → 碱变性 → 转膜 → 固定 → 杂交 → 洗涤 → 放射自显影 变性(NaOH 0.5mol/L) 转膜(NC膜,尼龙膜) 固定(80℃,4-6h) 杂交(高盐浓度,68℃,几小时) Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析,确定特异性DNA序列的大小和定位。 * * 主讲:徐建余 3726374 jianyuxuone@163.com 生物科学系 中心法则 (The Central Dogma) 转 录 翻 译 逆转录 复 制 一、核酸的水解 二、核酸的酸碱性质 三、核酸的紫外吸收 四、核酸的变性、复性与杂交 上册502页 糖苷键和磷酸二酯键 蛇毒磷酸二酯酶 牛脾磷酸二酯酶 一、核酸的水解 (一)酸水解 对酸的敏感性:糖苷键>磷酸酯键 嘌呤糖苷键>嘧啶糖苷键 脱嘌呤: pH1.6,37℃,对水透析 pH2.8,100℃,1h 脱嘧啶: 98-100%甲酸,175℃,2h 三氟乙酸,155℃,60min (DNA)或80min(RNA) 利用酸水解可以研究核酸的碱基组成 (二)碱水解 RNA的磷酸酯键对碱敏感 室温,0.3~1mol/L KOH,24h,可将RNA完全水解,得到2′-或3′-核苷酸的混合物。 DNA抗碱水解 生理意义: DNA更稳定 ,遗传信息。 RNA是DNA的信使,完成任务后迅速降解。 (三)酶水解 非特异的磷酸二酯酶:phosphdiesterase 蛇毒磷酸二酯酶水解DNA(RNA)得5′-核苷酸 牛脾磷酸二酯酶水解DNA(RNA)得3′-核苷酸 特异的磷酸二酯酶:nuclease
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