[理学]0711第十一章 层析技术se-zanshi.ppt

第十一章 层析技术 生物分离过程的一般流程 层析技术（chromatography） 一、层析技术一般原理 色层分离法基本原理 层析分离法基本原理 基本概念 （1）分配系数 溶质在固定相与流动相浓度比值 （2）解离常数 有效结合离子浓度与溶质在液相的浓度乘积与 溶质在固相中的浓度比值 （3）分离因素某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数 (4)? 阻滞因子分配层析溶质移动速度（距离）与流动 相移动速度（距离）比值 (5)?洗脱（容积）溶出体积 在柱色层分离中，使溶质从柱中流 出时所通过的流动相体积 (6)?分辨率 两峰之间的距离与两峰宽的平均值之比 (7) 理论塔板流动相与固定相平均浓度达传质平衡 时的一段柱高 （8）溶量因子固定相中溶质总量与流动相中溶质总量之比 分配系数 在一定的温度下，溶质在两液相之间的平衡关系服从分配定律： K = Cs/Cm K 为分配系数 Cs，Cm为组分在固定相和流动相中的浓度。 应用条件：温度一定 低浓度 解离常数和分离 因数 洗脱容积Ve 理论塔板fr—第r块塔板上溶质的质量分数为： 二、层析技术分类及应用 薄膜层析 层析法分类及原理（按分离原理分类 ） 各类层析的原理和载体 1、吸附层析（absorption chromatography） 树 脂 的 网 络 骨 架 活 性 炭（Active carbon） 氧化铝 硅胶 主要优点是化学惰性，具有较大的吸附量，易制备不同类型的多孔硅胶，一般以SiO2.xH2O通式表示。 吸附法 典型的吸附过程包括四个步骤： 2、分配层析 逆流分溶原理示意图 分配层析技术 层析柱分离物质的示意图： 3、凝胶层析（gel-filtration chromatography） 凝胶层析原理示意图 凝胶层析与洗脱曲线 洗脱体积与相对分子质量的关系 4、离子交换层析（ion-change chromatography） 离子交换层析原理示意图 常用的阳离子交换剂 常用的阴离子交换剂 5、亲和层析（affinity chromatography） 亲和吸附分离是利用溶质和吸附剂之间特殊的化学作用，从而实现分离。 吸附剂由载体（Carrier）和配位体(Ligand)组成 亲和层析原理示意图 6、聚焦层析（Chromatofocusing） 层析装置与操作 装置 1 普通 2 高级 柱操作 （1）装柱：均匀，无气泡 （2）平衡（equilibrium)：缓冲液,pH, 盐浓度 （3）上样(loading)：蛋白浓度，pH, 盐浓度，缓冲液 （4）洗涤(washing)：pH, 盐浓度，洗涤剂，缓冲液 （5）洗脱(elution)：条件与吸附相反 （6）清洗(cleaning)：弱酸，弱碱，蛋白质变性剂（尿 素，盐酸胍，硫氰酸盐 （7）再生：与平衡条件相同 装 置 ⑴泵 ⑵混合器 ⑶层析柱 ⑷检测器 ⑸记录仪 ⑹分部收集器 装　　　柱 调糊：50%（缓冲液＋介质） 一次连续加入悬胶液 打开出口阀：层析剂沉降 排除空气 检查均匀度 上样 样品处理： (1）溶解 A 调整浓度 B 盐 C pH (2) 过滤：除去不溶物 流速：根据样品浓度与吸附速度而定 上样量：80%吸附容量 淋洗（去除残留在介质中的杂质） 盐浓度 pH 表面活性剂（0.1-0.5%) 淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定 防止产物丢失又要除去杂质 洗脱方法 按操作方式 a 恒定洗脱 (isocratic elution) b 分步洗脱 (stage elution) c 梯度洗脱 (gradient elution) 按洗脱机理 专一性洗脱（specific elution） 非专一性洗脱（nonspecific elution） 添加剂：乙二醇, NaCNS 、脲素、盐酸胍 洗脱体积：5倍床体积 清洗与再生 弱酸：HAC 碱：氨水 促溶剂：1-3M KCNS、 6-8 M 尿素、 6 M盐酸胍 极性溶剂：20% 乙醇 表面活性剂：吐温-80 缓冲液平衡 几种主要层析方法比较 强酸性 （001-099）