乌桕D-12脂肪酸脱氢酶基因的克隆与功能分析.pptVIP

Cloning and characterization of a novel ∆12-fatty acid desaturase gene from the tree Sapium sebiferum Biotechnol Lett. (2007) 29:959–964 Introduction Materials and methods Results and discussion 脂肪酸去饱和酶在生物体的脂肪酸代谢和生物膜的构成中起着非常重要的作用。它们的两种类型分别是可溶型和膜结合型。膜结合型的∆12-FADs(∆ 12-fatty acid desaturase)催化油酸(18:1 ∆9)转变为亚油酸(18:2 ∆9 ,12 )，并使之结合内质网膜(FAD2)或质体膜(FAD6)上，编码该酶的基因已经在油桐(Vernicia fordii)、麻风树 (Jatropha curcas)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和大豆(Glycine max)中得到克隆。 乌桕是双子叶大戟科植物，是一种生长快速用途广泛的热带和亚热带树种，根皮、树皮、叶均可入药，种子含油量高达41–47%，其中约有60%是不饱和脂肪酸，是工业用木本油料树种之一 。近年来的研究多集中在利用基因操作来提高油脂化学品的含量。因此，要研究与贮藏脂质的合成及膜性质相关的脂质去饱和作用的基因调控，首先要克隆和鉴定去饱和基因。 1 Total RNA isolation 从乌桕的幼嫩种子、根、茎和叶中提取RNA。用琼脂糖凝胶电泳及分光光度法测定RNA的质量和浓度，并储存在-70℃以备RACE和Real time PCR(荧光实时定量PCR)用。 2 Cloning of the full-length cDNA of Ssd12 以油桐和大豆基因序列的保守区设计引物12L2 和12R2来扩增cDNA的第一条链， 用三个通用引物oligo(dT)18、AP1、AP2和五个特异引物1231、1232、1251、1252、1253来扩增Ssd12的3’和5’末端序列，用引物12L和12R扩增全长cDNA。PCR产物克隆到载体pMD-18T上进行序列分析。 本研究克隆了乌桕的Ssd12基因，并将该基因转入酿酒酵母中鉴定其功能。 3 Southern blot analysis 用CTAB法从5 g幼嫩叶片中提取基因组DNA，用不同的限制酶消化DNA，0.8 %琼脂糖电泳分析。碱变性后将DNA真空印迹和紫外交联到带正电的尼龙膜上，全长 Ssd12 cDNA作为探针进行杂交，并用DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ试剂盒标记。 4 Quantification real time RT-PCR 设计两对引物w121和w122、w18s1和w18s2 扩增Ssd12和18s rRNA基因，根据说明书将每个质粒DNA稀释10倍后(105–1010 copies/ul )制作这两个基因的标准曲线。利用实时荧光用iCycler iQ连续定量PCR产物。用2-∆∆CT法分析荧光实时定量PCR产物。 5 Functional characterization of Ssd12 in yeast 用特异引物12ORF1和12ORF2扩增Ssd12的编码区，并克隆到pYES2.0上获得表达型pYSsd12，通过测序来保证克隆产物的高保真性，并转化酿酒酵母菌株Invsc1。 6 Fatty acid analysis 提取酵母细胞总脂肪酸含量并加入甲醇使其甲基化，脂肪酸甲酯(FAMEs)含量用CP-7638 GC和GC-MS分析,十五酸甲酯作为内标。 1 Cloning and characterization Ssd12 from Sapium sebiferum 根据油桐和大豆基因序列的保守区(histidine-rich box2 and 3)设计的简并引物进行RT-PCR扩增，得到一个长度为677 bp的cDNA片段，该片段与油桐的∆12-FAD基因序列的相似性为88%，与大豆的相似性为82%。用特异引物获得该基因的全长，5’RACE和3’RACE分别得到一段长596 bp和677 bp的片段，通过测序并设计引物获得该基因的cDNA全长。序列分析结果表明cDNA全长为1521 bp，包含一个1146 bp的开放阅读框、一个130 bp 5’非编码区、一个245 bp的3’非编码区。该cDNA的蛋白产物包含381个氨基酸残基，该蛋白与高等植物的∆12-FADs具有很高的同源性，都含有三个富含组氨酸的基序(H-BOX1, H-BOX2和H-BOX