细菌DNA提取方法的优化.doc

细菌DNA提取方法的优化 摘要：文章采用大肠杆菌和水稻白叶枯病菌作为实验菌株，研究了其在不同的超声时间，不同的破壁方法，不同的酶作用下dna提取的效果。通过实验结果比对、优化，得出一种准确、高效的dna提取方法。 关键词：细菌dna提取；紫外分光光度计；大肠杆菌；水稻白叶枯病菌 本文选用了大肠杆菌和水稻白叶枯病菌作为实验菌株，将培养一定时间的菌种所提取的dna，在紫外分光光度计下进行测定。实验首先研究超声时间对大肠杆菌dna提取效果的影响，其次在传统法、水煮法、es法（传统法+溶菌酶）、esu法（传统法+超声+溶菌酶）之间进行比较，分析不同提取方法提取的两种菌株dna的浓度及纯度，找出了一种准确、高效的dna提取方法，为今后生物检测鉴定工作提供了保障。 一、实验部分 （一）实验材料 大肠杆菌：革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×（1～3）μm。周身鞭毛，能运动，无芽胞，是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，主要寄生在大肠内。 水稻白叶枯病菌：革兰氏阴性菌，由水稻黄单胞细菌水稻致病变种侵染引起的严重危害水稻生产的一种植物细菌。 （二）实验方法 1．细菌的培养。根据两种细菌不同的生长条件制备相应的培养基，具体如下： 水稻白叶枯病菌：（na培养基）牛肉浸膏3g，蛋白胨7.5g，蔗糖10g，加蒸馏水至1000ml，调至ph7.0，121℃灭菌20min。固体培养基加1.5%琼脂。 大肠杆菌：（lb培养基）细菌培养用蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl 10g，加蒸馏水至1000ml，调至ph 7.0，121℃灭菌20min。固体培养基加1.5%琼脂。 大肠杆菌培养基放置于37℃的摇床上培养12h，水稻白叶枯病菌培养基放置于28℃的摇床上培养48h，由液体培养基的浑浊度来判断细菌的生长情况。 2．细菌dna的提取。 （1）传统提取法。 步骤一：取3ml过夜培养菌液于离心管中，离心1min，弃上清液，收集菌体； 步骤二：加800micro;l裂解缓冲液（40mm tris-醋酸，ph 7.8的20mm 醋酸钠，1mm edta，10% sds），吹打混匀（枪头去尖）； 步骤三：加400micro;l 5m nacl混匀后，离心12min（时间不能少）； 步骤四：将上清液移至另一离心管中，加入10 micro;l rnasea（10mg/ml）37℃温浴30min； 步骤五：加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25︰24︰1）抽提，充分混匀抽提； 步骤六：离心8 min收集上清，用氯仿抽提一次，离心8 min后吸取上清至新的离心管内； 步骤七：加2倍体积无水乙醇沉淀dna后离心8 min，用70％乙醇洗涤沉淀2次。 步骤八：干燥后，溶于100 micro;lte中于-20℃保存备用。 （2）水煮提取法。取过夜培养的菌液3 ml加入到离心管中离心1 min，弃上清；沉淀加入1.2 ml无菌去离子水，振荡混匀，100℃水浴10 min后离心5 min，上清即为dna溶液，-20℃保存备用。 （3）超声时间对dna提取效果的影响。在传统提取法步骤二后使用超声波（功率400 w）超声1、3、5和7 min，其他步骤同传统法。 （4）溶菌酶对细菌dna提取效果的影响。在传统提取法步骤一之后加入20micro;l50 mg/ml的溶菌酶，37℃温育30 min（不断振荡），其他步骤同传统法。 （5）超声、溶菌酶双重效应对dna提取效果的影响。在传统提取法步骤一之后加入20 micro;l 50 mg/ml溶菌酶，37℃温育30min（不断振荡），步骤二之后超声（功率400w）3 min，其他步骤同传统法。 3．dna浓度/纯度测定。agilent 8453紫外分光光度计开机、开灯预热30min；用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入te缓冲液后，放入样品室的s池架上，关上盖板；设定狭缝后校零。将标准样品和待测样品适当稀释（dna15 micro;l用te缓冲液稀释至3000 micro;l）后，记录编号和稀释度。把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的s架上，关闭盖板；设定测定的紫外光波长，测定260nm、280nm波长时的od值及od260/od280的比值；计算待测样品的浓度（μg/micro;l）=od260×稀释倍数×50/1000。 二、结果分析与讨论 （一）超声时间对大肠杆菌dna提取效果的影响 实验采用经过12h恒温摇床培养的大肠杆菌作为实验菌种，利用传统提取法、传统法结合超声处理1min、3min、5min、7min的方法提取dna，每种方法所用大肠杆菌菌液量均为3ml，利用紫外分光光度计对提取的dna测定3次，结果取平均值，实验结果如图1、表1所示： 由表1可知，提取的dna浓度随着超声时间的延长而增大，这主要是因为超声使细菌细胞壁更容易