[理学]克隆载体.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 4.YAC的主要用途 YAC克隆重叠群是物理图谱的主要框架: 可容纳大片段(100-1000 kb)的外源DNA，在构建基因组文库时需要较少的克隆 在人类、植物、昆虫、鸟类、两栖类等复杂的生物基因组分析和DNA测序中发挥着重要作用。相比于早期DNA载体，YAC是容纳大片段外源DNA的首选载体，成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工染色体(HAC)的研究 基因功能研究中，基因嵌入及转基因技术都采用YAC克隆系统。通过YAC嵌入的基因不仅片段长，而且嵌入的基因更适于体内表达，并有利于基因保持其固有的空间构象和功能的发挥 * * 5.YAC的缺点 插入片段大，稳定性较差，不易操作 插入的大片段常发生缺失，使文库不完整 YAC与酵母天然染色体分子结构相似，分离时难与天然染色体分开 文库中的嵌合现象严重 因插入片段大，往往发生序列重排，造成序列错乱 * * III.细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC） 1992年Shizuya基于细菌性因子（F因子）的复制点和氯霉素抗性标记基因，在F质粒（pMBO131）基础上构建了高容量的第一代BAC人工染色体（350kb） BAC载体在重组缺陷型（REC－）宿主菌只有1个拷贝,有利于保持DNA大分子，尤其是重复序列多的DNA大分子，在细胞内稳定复制而不发生重组 F因子（100kb）又称致育因子，在细菌细胞内能自我复制，能整合到宿主染色体中。并能高频率的转移遗传标记。因其低拷贝特性使其重排和嵌合程度低。且F因子呈闭环结构，可以用常规技术从大肠杆菌中分离 * * 细菌人工染色体的结构 F因子的parA，parB，parC基因以保证单拷贝的BAC质粒在大肠杆菌分裂时均匀分配到子代细胞 起始oriS基因，严密控制，决定低拷贝和起始 解旋酶基因－repC，易于DNA复制和决定复制方向 选择标志基因Cmr－氯霉素抗性基因 lacZ基因－颜色鉴别重组子，外源基因插入其中 loxP和cosN位点，易于克隆DNA回收和操作 在多克隆位点两侧，还有T7及SP6启动子位点，用于制备RNA分子，进一步分析克隆的基因表达，作为染色体步行的探针，以及序列测定克隆的片段 * * BAC基因组文库的构建 BAC载体的制备 BAC DNA的分离 BAC DNA经酶切（HindIII）线性化 去磷酸化反应 高分子量基因组DNA的制备 大分子量HindIII酶切片段的制备 脉冲电泳选择酶切片段 BAC克隆 电转化 AC克隆鉴定 * * IV.哺乳类人工染色体 哺乳类人工染色体（MAC）则是以哺乳动物细胞作为宿主细胞的人工染色体技术，作为异源DNA片段的载体，比YAC容量大。 哺乳类人工染色体比YAC大2～3倍 MAC的优点：能容纳更大的基因，维持基因的拷贝数，没有副作用，能长期调控基因表达 人类人工染色体（HAC）可用作基因治疗 * * * 作为基因治疗理想的基因转移新载体，MAC有以下优点： 携带的外源基因容量大(500～600kb)，可以满足几乎所有的单个基因的基因组DNA的需要 可以携带较长片段的基因表达调控顺序，能够较好地调节基因表达水平以及基因的靶向表达 外源基因存在于人工染色体中，可以不整合到细胞基因组中，因而不会激活原癌基因或使其它有功能基因失活，而且理论上能够在细胞中较稳定地存在 * * 第四节 表达载体 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 在非必需区域内含有两个相同的酶切口，两者间的距离为22kb长，使用时用酶切开，分离去除这个22kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之 载体的容量比插入型载体大，有载装下限为10.4而上限为25.5kb。实际应用时不需要标记基因，因为空载体DNA只有26kb，不能被包装，无法进入受体细胞 这类载体的使用较为繁琐，现在商品化的取代型载体已去除了中间片段（22kb）解决了这一问题 替换型载体 * * 简介：一种替换型载体 特点：能插入大的DNA片段（最大20kb） 具有包装下限（插入外源片段至少为12kb） 应用：主要应用于构建基因组文库 举例：Charon4 * * C.λDNA的体外包装 与外源基因形成的重组λDNA分子在体外需人工包装成有感染活性的噬菌体颗粒，方可高效导入受体细胞 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化 包装蛋白通常分为头部和尾部蛋白。当这两部分包装蛋白与重组λDNA分子混合后，包装才能有效地进行 其中在A蛋白（有终止复