[理学]基因工程哺乳动物基因工程1.ppt

D 高等哺乳动物的基因转移 A 高等哺乳动物基因工程的基本概念 B 高等哺乳动物的受体系统 C 高等哺乳动物的载体系统 D 高等哺乳动物的基因转移 E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白 哺乳动物细胞的物理转化法 哺乳动物细胞的病毒转染法 （一）哺乳动物细胞的物理转化法 利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是 外源基因表达盒中不含任何病毒基因序列，这对外源 基因表达产物的分离纯化减轻了负担。 但外源基因表达盒进入受体细胞后，往往以多拷贝的 形式随机整合在染色体DNA上，导致受体细胞基因灭活、 外源基因不表达。 将待转化的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2溶液混匀，此时 DNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒内； 1. 磷酸钙共沉淀法 将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，37℃保温4-16小时此 时细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙晶体局部溶解膜结构，DNA便进入受体 细胞； 弃去DNA溶液，加入新鲜培养基，继续培养7天即可筛选转化株。 如果在外源DNA中掺入少量的受体细胞内源性DNA可以提高转化 效率。利用磷酸钙共沉淀法转化肿瘤病毒DNA，可使正常细胞转化为 癌细胞，这是人们对肿瘤发生机制的最早理解。 将待转化的DNA溶解受体细胞悬浮液中，然后加入电击 转化仪的样品槽内，两端施加瞬时高压电场，使细胞膜产 生细小的缝隙，此时，DNA片段便可不经过胞饮作用直接 进入受体细胞。 电击转化法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型， 如生长在悬浮液中的淋巴细胞等。 2. 电击转化法 将待转化的DNA溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后者 在表面活性剂的存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构。 利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞 和HeLa细胞。 3. 脂质体介导法 将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细 胞膜融合，DNA随即进入胞质和核内。 通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后 杀死雌鼠，从其输卵管内取出受精卵； 上述程序多用于动物个体的转基因过程，由于必须单细胞 逐一操作，所以不太适用于基因的克隆和表达。 4. 显微注射法 借助于显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入到受精卵中变大 了的雄性原核内。 血影细胞是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、 低渗环境下发生溶血，血红蛋白大量溢出，最后形成仅被 细胞膜包裹的细胞核结构。 因此，可先将外源DNA转入血影细胞，然后再将血影细胞与受体细胞在适当条件下发生融合，从而将外源DNA转入受体细胞。 5. 血影细胞介导法 在溶血过程中，红细胞膜的通透性大增，在血红蛋白溢出的同时，外源DNA也容易进入。当上述外界条件消失后，红细胞膜又可恢复原来的通透性。 (二) 哺乳动物细胞的病毒转染法 以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型 病毒颗粒共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、 实验重复性佳、导入效率高等优点，但也存在一定的缺陷， 如目前常用的载体宿主范围有限，往往无法转染一些具有重 要经济价值的家禽和牲畜细胞等。 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体 利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂 利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIII （一）哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊 方式。 1. 通过强化基因扩增高效表达外源基因 氨甲喋呤(MTX)是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还 原酶(DHFR)的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处 理后，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性 细胞中，dhfr基因均得以扩增。 这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高 关键代谢酶的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。 更重要的是，扩增的区域远远大于dhfr基因本身，即与 dhfr基因相邻的DNA区域同时被扩增。 1) DHFR-MTX高效表达系统 DHFR-MTX高效表达系示意图 外源基因 dhfr 转染dhfr -细胞系 单克隆 培养 转移 0.05 mM MTX 培养 单克隆 转移 培养 单克隆 转移 5 mM MTX 0.25 mM MTX 培养 单克隆 外源基因扩增至100拷贝 2) GS-MSX高效表达系统 谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亚砜（MSX）对动 物细胞的毒害作用。 先将带有GS编码基因的载体转入培养的哺乳动物细胞中， 由于只有多拷贝的GS编码基因才能抗MSX，所以在转染过程 中不必使用GS缺陷型的受体细胞； 而且在正常的MSX浓度下就能筛选到含有高拷贝外源基因 的转染细胞，这是GS-MSX系统比DHFR-MTX系统优越之处。 2. 通过强化基因转录高效表达外源基因