多种质粒提取方法.doc

从细菌中分离质粒 DNA 的具体操作 材料、设备及试剂 　　一、材料 　　含PBS的E.coliDH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料离心管（又称eppendorf管），离心管架。 　　二、设备 　　微量取液器（20μl，200μl，1000μl），台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器（灭菌锅），涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。 　　三、试剂 　　1、LB液体培养基（Luria-Bertani）：称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。 　　2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。 　　3、氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存备用。 　　4、溶菌酶溶液：用10mmol/LTris?Cl（pH8.0）溶液配制成10mg/ml，并分装成小份（如1.5ml）保存于-20℃，每一小份一经使用后便予丢弃。 　　5、3mol/lNaAc（pH5.2）：50ml水中溶解40.81gNaAc?3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100ml，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。 　　6、溶液1:50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。 　　7、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1％SDS。 　　8、溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。 　　9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/LTris?Cl（pH7.5），15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml 　　的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20℃。 　　10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联，应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羟基喹啉（作为抗氧化剂），并用等体积的0.5mol/LTris?Cl（pH8.0）和0.1mol/LTris?Cl（pH8.0）缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上，因为酸性条件下DNA会分配于有机相。 　　11、氯仿：按氯仿：异戊醇＝24：1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积＝1：1混合上述饱和酚与氯仿即 　　得酚/氯仿（1:1）。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。 　　12、TE缓冲液：10mmo/LTris?Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。 　　13、STET：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris?Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0），5%TritonX-100。 　　14、STE：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris?Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。 　　15、电泳所用试剂：（1）TBE缓冲液（5×）：称取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA（pH8.0）20ml，定溶至1000ml。（2）上样缓冲液（6×）：0.25%溴酚蓝，40%（w/v）蔗糖水溶液。 操作步骤 　　一、细菌的培养和收集 　　将含有质粒pBS的DH5α菌种接种在LB固体培养基（含50μg/mlAmp）中，37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mlLB液体培养基（含50μg/mlAmp）中，37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。 　　二、质粒DNA少量快速提取 　　质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样，所得DNA有一定纯度，可满足限制酶切割、电泳分析的需要。 　　（一）、煮沸法 　　1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中，4℃下12000ｇ离心30秒。 　　2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。 　　3、将菌体沉淀悬浮于120mlSTET溶液中，涡旋混匀。 　　4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml），涡旋振荡3秒钟。 　　5