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多种质粒提取方法
从细菌中分离质粒 DNA 的具体操作
材料、设备及试剂
一、材料
含PBS的E.coliDH5α或JM系列菌株,1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心管架。
二、设备
微量取液器(20μl,200μl,1000μl),台式高速离心机,恒温振荡摇床,高压蒸汽消毒器(灭菌锅),涡旋振荡器,电泳仪,琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。
三、试剂
1、LB液体培养基(Luria-Bertani):称取蛋白胨(Tryptone)10g,酵母提取物(Yeastextract)5g,NaCl10g,溶于800ml去离子水中,用NaOH调pH至7.5,加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。
2、LB固体培养基:液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。
3、氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液:配成50mg/ml水溶液,-20℃保存备用。
4、溶菌酶溶液:用10mmol/LTris?Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。
5、3mol/lNaAc(pH5.2):50ml水中溶解40.81gNaAc?3H2O,用冰醋酸调pH至5.2,加水定容至100ml,分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。
6、溶液1:50mmol/L葡萄糖,25mmol/ L T r i s. Cl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。
7、溶液Ⅱ:0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/LNaOH母液稀释),1%SDS。
8、溶液Ⅲ:5mol/LKAc60ml,冰醋酸11.5ml,H2O28.5ml,定容至100ml,并高压灭菌。溶液终浓度为:K+3mol/L,Acˉ5mol/L。
9、RNA酶A母液:将RNA酶A溶于10mmol/LTris?Cl(pH7.5),15mmol/LNaCl中,配成10mg/ml
的溶液,于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20℃。
10、饱和酚:市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1%的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/LTris?Cl(pH8.0)和0.1mol/LTris?Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,因为酸性条件下DNA会分配于有机相。
11、氯仿:按氯仿:异戊醇=24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积=1:1混合上述饱和酚与氯仿即
得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性,操作时应戴手套。
12、TE缓冲液:10mmo/LTris?Cl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。
13、STET:0.1mol/LNaCl,10mmol/LTris?Cl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0),5%TritonX-100。
14、STE:0.1mol/LNaCl,10mmol/LTris?Cl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。
15、电泳所用试剂:(1)TBE缓冲液(5×):称取Tris54g,硼酸27.5g,并加入0.5MEDTA(pH8.0)20ml,定溶至1000ml。(2)上样缓冲液(6×):0.25%溴酚蓝,40%(w/v)蔗糖水溶液。
操作步骤
一、细菌的培养和收集
将含有质粒pBS的DH5α菌种接种在LB固体培养基(含50μg/mlAmp)中,37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mlLB液体培养基(含50μg/mlAmp)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。
二、质粒DNA少量快速提取
质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
(一)、煮沸法
1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。
2、弃上清,将管倒置于卫生纸上几分钟,使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120mlSTET溶液中,涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml),涡旋振荡3秒钟。
5
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