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关于PET-28a载体的表达 用PET-28a载体的原核表达出来的蛋白一般会是出现在上清呢，还是会出现沉淀中啊？这个载体表达出来的一般是不是包涵体？ 用pet-28a载体的原核表达出来的蛋白在破菌前肯定会出现在菌体沉淀中，不会分泌在培养基上清中的。至于破菌以后，表达出来的在沉淀中还是在上清中，要由目标蛋白的性质来定了，没有固定形式的。至于是否是包涵体，主要也是由目的蛋白的性质与表达量来决定的，pet-28a这种载体没有本身溶解性高的多肽融合蛋白，也没有催化二硫键形成的酶融合蛋白，而且不含信号肽序列，所以同一种蛋白用这个载体，形成包涵体的可能性更大些。 楼主是的是大肠杆菌作为外源基因表达的宿主吗？相对其他生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源生物基因，特别是外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数的外源基因即便能分泌表达，其表达率通常也比包涵体方式低得多。蛋白产物N端信号肽序列是蛋白质分泌的前提条件，如果楼主用pet-28a载体表达的外源基因的5端不带有信号肽序列的话，将如eastrocket战友所言，表达出来的蛋白在破菌前肯定会出现在菌体沉淀中，但异源蛋白在原核细胞中的定位可能会有两种情况，可能是以可溶性存在或不可溶性（包涵体）存在于细胞质中，这主要取决于的异源蛋白的性质和表达量。 概念 pEGFP-N3载体为真核细胞表达载体。 pEGFP-N3载体特点 　　①从结构上看，该质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一； 　　②含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达； 　　③具有多克隆位点，便于目的基因的插入； 　　④该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。 　　这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达。 　　pEGFP-N3载体上携带有EGFP蛋白表达基因，如上图质粒图谱所示。 GFP的相关知识 　　绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因来源于Jellyfish Aequorea Victoria， 是Shimomura等于1962年发现的蛋白质，由238个氨基酸组成，分子量约为27Kd。GFPGFP在包括热、极端PH和化学变性剂等苛刻条件下都很稳定，用甲醛固定后会持续发出荧光，但在还原环境下荧光会很快熄灭。 　　与以往常用的报告基因相比，GFP具有以下优点： 　　①在荧光显微镜下，用波长约490 nm的紫外线激发后，即可观察到绿色荧光，直接、简捷、便于检测； 　　②无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检出率； 　　③蛋白本身性质稳定； 　　④可在多种异源生物中表达且无细胞毒性； 　　⑤其基因片段长度较小(约717 bp)，易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性，为研究其他基因表达产物的分布提供了方便。 　　EGFP是一种优化的突变型GFP，使其产生的荧光较普通GFP强35倍，大大增强了其报告基因的敏感度。EGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子，而且其N及C端均可融合，并不影响其发光。 NotⅠ 　　限制性内切酶，由豚鼠耳炎诺卡氏菌产生。 　　识别位点是：GCGGCCGC 　　切割后的片段具有黏性 　　它属于 限制性内切酶Ⅱ类。 BamHⅠ 　　限制性内切酶，由淀粉芽孢杆菌产生。 　　识别位点是：GGATCC 　　切割后的片段具有黏性 　　它属于限制性内切酶Ⅱ类。 报告基因 报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。 重组质粒 基本简介 　　质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。 反应策略 带有非互补突出