胡萝卜愈伤组织培养及继代培养(实验报告).doc

本科学生综合性实验报告 学号： 094120275 姓 名： 陈 小 华 学院： 生命科学学院 专业、班级：09应用生物教育B班 实验课程名称： 胡萝卜的愈伤组织诱导培养及继代培养 教 师： 杨 世 忠 开 课 学 期： 2011 至 2012 学年 第二 学期 填 报 时 间： 2012 年 5 月 18 日 云南师范大学教务处编印 实验序号 实验二 实验名称 胡萝卜的愈伤组织诱导培养 实验时间 2012年3月-5月 实验室 组培实验室 （一）、实验目的 1.熟练掌握配制与保存培养基母液的基本技能。 2.熟练掌握培养基配制的基本技能，并能根据实验目的设计适合的培养基配方。 3.学会设计和配制胡萝卜愈伤组织增殖培养基。 4.熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术。 5.掌握组培室常用的化学试剂。 6.学会设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。 7.熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术。 （二）、实验原理、实验流程或装置示意图 1、实验原理 （1）配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。 （2）愈伤组织（callus）原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促使砧木与接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木和接穗沟通；在扦插中，从伤口愈伤组织可分化出不定根或不定芽，迸而形成完整植株。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。其发生过程是：外植体中的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。愈伤组织的生长是发物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大的影响。此外，PH还影响到琼脂培养基的凝固情况。所以，当培养基配制好后应立即进行PH值的调整。培养基若偏酸时用氢氧化钠 （1mol·L-1）来调节，若过碱就用盐酸 （1mol·L-1）来调整。当PH值高于6.0时，培养基将会变硬；当PH值低于5.0时5.0时，琼脂不能很好地凝固。 （4）植物组织培养的优点： ① 研究材料来源单一，无性系遗传背景一致； ② 经济方便效率高； ③ 条件可控误差小； ④ 生长快周期短重复性强； ⑤ 可周年试验或生产。 （5）组织培养实验室布局的总体要求： 便于隔离，便于操作，便于灭菌，便于观察。 （6）组培上常用的灭菌方法有物理和化学法。 常用的物理方法有： 物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌、过滤、离心、沉淀等。 常用的化学方法： 消毒剂、抗菌素灭菌。 不同物品要选用不同的灭菌方法。 实验室中常用仪器设备及其灭菌方法如下： ①培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法。具体方法如下： 压力在9.8×104—10.8×104Pa，温度在121℃，灭菌20—30min。 ②玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌、干热消毒灭菌 ③塑料器皿灭菌：多采用高压蒸汽消毒灭菌 ④金属用具灭菌：灼烧灭菌。具体方法是：浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用。 ⑤接种室灭菌：紫外灯照射、空气消毒灭菌。 超净工作台：紫外灯照射，70%—75%的酒精擦洗。 ⑥外植体灭菌： 水冲洗10—20min或更长时间 70%—75%酒精中浸泡30s 0.1%—0.2%氯化汞液中浸泡10min左右 蒸馏水冲洗4—5次 备用。 2、实验流程 （1）实验总体流程： （2）无菌操作流程： 胡萝卜愈伤组织诱导培养流程： (4)胡萝卜愈伤组织的继代培养流程： （三）、实验设备及材料 1、实验材料 新鲜的胡萝卜贮藏根 2、实验设备 （1）配制MS母液培养基所需的仪器设备和药品： ①仪器设备： 电子天平、烧杯、容量瓶、细口瓶、药勺、玻璃棒、电炉、量筒。 ②药品： NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、 MgSO4·7H2O、KH2PO4、KI、H3BO3、MnSO4·4H2O、 ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、 CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、 Na2-EDTA·2H2O、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素 (维生素B1)、甘氨酸、蒸馏水