张晓辉生物化学与分子生物学.ppt

张晓辉 途径工程(Pathway Engineering) 途径工程(Pathway engineering)，被称为第三代基因工程，改变代谢流向，开辟新的代谢途径是途径工程的主要目的。 途径工程是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及进行遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科。途径工程在分析代谢途径的基础上，定性地改变细胞内代谢流走向，调整原有代谢网络，进而提高特定代谢物的产量。外源基因的准确导入及其编码蛋白的稳定表达，可以拓展细胞内现有代谢途径的延伸路线，以获得新的生物活性物质或者优良的遗传特征。 生物去污的优点： 1）条件温和； 2）成本低； 3）有一定的专一性和可选择性； 4）比较彻底，几乎无二次污染； 5）可以解决传统方法无法解决的污染； 。。。。。。。。。。。 许多微生物天生就具有这种降解、转化，或者螯合各种毒性化学药物的能力，但效率都比较低。所以有必要通过途径工程对这些微生物进行操作或改造，提高其去污的能力，进而实现去污的目的。 1、一些重金属污染的生物去除 当遇到重金属时，大多数微生物都会做出反应产生金属鳌合肽 ，比如植物螯合肽（PCs）和金属硫蛋白（MTs） 在大肠杆菌里使负责PC合成的拟南芥植物螯合肽合成酶（AtPCS）过表达，使金属堆积提高到20倍。 类似成就还有在共生根瘤菌细菌中。 但合成PC的前体物质谷胱甘肽（GSH）的限制成了重金属的堆积的瓶颈。 解决方法： 1）共表达负责产生GSH的酶，结果PC的合成增加了10倍 ； 2）通过在能够提供足够的GSH的啤酒酵母中表达PC合酶 。 另外，MTs和PCs的一个特点是非选择性结合各种重金属。 解决方法： 1）改造特定重金属的转运体 2）提高吸收的能力 3) 利用在特定的金属污染场所自然突变的金属结合MTs 金属调节蛋白在去除重金属污染中也发挥着重要的作用，通过设计提高其高亲和性和自然选择性，并应用到汞和砷的特异聚集中。 2、放射性污染的生物去除 自然存在的高耐受放射的细菌是提高放射 性污染净化的理想代谢设计候选对象 。 Brim等第一次报道使用极端放射耐受和嗜热细菌Deinococcus geothemalis通过编码表达大肠杆菌里的mer操纵子实现对Hg2+的还原。这种工程菌能够在较高温度和电离辐射下还原汞。而其还能还原Fe(Ⅲ)，U(Ⅵ)和Cr(Ⅵ)。 在P. aeruginosa中通过多聚磷酸激酶和外切聚磷酸酶的过表达，聚磷酸酯也能使放射物以金属磷酸盐的形式凝结 最近一种非特异磷酸酯酶phoN在放射耐受性细菌D. radiodurans中获得表达，使铀从稀释的核废料中生物凝结 。 定向诱导也被用来改善铬酸盐和铀酰还原酶的酶效率。 1、有机磷酸盐（OPs）的生物去除 有机磷酸酯水解酶（OPH）具有降解Ops的能力。OPH能够催化P-O键的水解，释放p-硝基酚基团。 因为磷酸酯的水解可以显著地减少Ops的毒性，许多研究人员就把注意力集中到了OPH的最初水解上。 可以应用基因工程技术如DNA同源重组技术，定向诱导，或者错位PCR技术来提高OPH的催化活性和底物专一性。 运用DNA同源重组技术分别获得了甲基硝苯硫酸酯（杀虫剂）和氯螨硫磷（杀虫剂）的25倍和725倍的高水解效率的突变体。 另外，运用细胞表面酶的易位，并通过解除Ops通过细胞膜的转换瓶颈增强生物解毒的效率。 运用Lpp(lipoprotein脂蛋白)–OmpA (outer membrane protein A外膜蛋白A) 系统将OPH释放到大肠杆菌表面，使硝苯硫酸酯的降解比OPH在细胞内表达要快7倍。目前，探索OPH分泌到细胞膜间隙的工作也已开展，以全面提高其水解效率。 尽管一些Ops能够初始水解转化成一些低毒的p-硝基苯(PNP)和二烃基磷酸盐，但这些降解产物依然含有毒性，抵抗生物降解。 一种能够水解硝苯硫酸酯和二乙基硫代硫酸酯的改造的大肠杆菌和具有天然降解PNP的Pseudomonas putida恶臭假单胞菌结合培养能够顺利分解硝苯硫磷酯，且没有PNP的积累。 改造的Moraxella sp摩拉克式菌属或者P. putida（Pseudomonas putida恶臭假单胞菌）也能自然地降低PNP。在前者中，OPH在细胞表面被表达，并证明能够同时降解硝苯硫磷酯，甲基硝苯硫磷酯和二乙硝苯磷酸酯，且它们的水解产物都是PNP。在后者中，运用了一个P. putida菌株，其包含一个固有的PNP降解操纵子。 在P. putida菌株中引入一个表达OPH，磷酸