影响限制性内切酶活性的因素.ppt

概括起来，诱发星活性的因素有如下几种： （1）高甘油含量（5％, v／v）； （2）限制性内切核酸酶用量过高（100U／ugDNA）； （3）低离子浓度（25 mmol／L）； （4）高pH（8.0以上）； （5）含有机溶剂，如DMSO（二甲基亚砜 ），乙醇等； （6）有非Mg2+的二价阳离子存在（如Mn2+，Cu2+，Co2+，Zn2+等）。 但在实际应用中，一般要用稍过量的酶（1μg加2~5U酶）反应较长的时间，才能达到完全酶解。但是不能过分加大酶的用量 酶过量对酶切反应的影响： 1）酶过量（一般为?100U/μgDNA）会影响识别序列的正确性，如：BamHI 的正常识别序列: GGATTC ；酶过量识别序列 NGATCN 2）酶制剂含甘油成分，酶过量，会因为甘油量大而影响其识别的专一性，诱发星号活力。 6. 酶对消化效率的影响 1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下1h，完全水解1μgDNA所需的酶量 1、限制-修饰系统 2、限制性核酸内切酶的命名和类型 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、影响限制性内切酶活性的因素 5、限制性内切酶对DNA的消化作用 第一节 限制性核酸内切酶 限制性内切酶对DNA的消化 1. 内切酶与识别序列的结合模式 1986年J.A. McClarin等通过X射线晶体衍射发现II型限制性内切酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。 GAATTC CTTAAG 2. 双酶切消化 两种不同的限制酶切割同一种DNA分子-构建载体。 对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 使用两种酶均适用的缓冲液，同时酶解 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切。 低温酶先切，然后升温，加入高温酶再切 双酶切反应体系 内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开 1 2 3 4 1 2 3 4 3 完全消化 DNA分子的G+C含量为50%，而且4种碱基的分布是随机的。最终片段大小是4nbp 只有有限数量的酶切位点被切开 通过缩短保温时间、降低反应温度、增大反应体积或减少酶量可达到局部消化的目的。 1 2 3 4 1 4 4 局部消化 限制性核酸内切酶的应用： 　　　重组DNA前的切割 构建新质粒 构建物理图谱 DNA分子杂交 用限制性内切酶消化受体DNA 制备DNA探针 亚克隆以用作序列分析 基因定位，DNA同源性研究 本节重点掌握的内容 　　 1、限制性核酸内切酶、同裂酶、同尾酶、星星活性。 　　 2、II型限制性核酸内切酶命名原则、操作注意事项及产生星活性的原因、影响酶活性的因素。 第二章 基因工程的酶学基础 第一节 限制性内切酶 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶和反转录酶 第四节 DNA修饰酶 第五节 外切核酸酶 第六节 单链内切核酸酶 第七节 RNA酶 * * * * * * * * * * 需两种酶切同一分子，酶对盐浓度相同，可同时反应。 需两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别不大，中，高盐，可同时反应。利于酶较贵重的盐浓度缓冲液。 两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别大，低，高盐，不可同时反应。 a) 低盐组先切，加热灭活后，补加盐浓度再切。 b) 沉淀后重新加入另一种盐浓度缓冲液 c）两种酶不能同时反应，有先有后。 * * R表示A+G；Y表示C+T；M表示A+C；K表示G+T；S表示C+G；W表示A+T；H表示A+C+T；B表示C+G+T；V表示A+C+G；D表示A+G+T；N表示A+C+G+T。 * * 识别序列 识别顺序的碱基数一般为4-6 bp，少数识别更长，多数识别位点具有旋转对称性（回文结构），少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性。 4bp 　 　　 HpaⅠ C ? CGG 　　　　　 HaeⅢ 　 GG ? CC 　　 5bp　　　　AvaⅡ 　 　 G? GWCC 　　　　 　 EcoRⅡ ? CCWGG 　　 6bp　 　　 BamHⅠ　　　G ?GATTC 　　　　　 SmaⅠ　　　　CCC ? GGG　　　11bp 　　 Bg1Ⅰ 　 GCCNNNN ?NGGC 　　　12bp　 　 BstXⅠ CCANNNNN ?NTGC 　　　　　　　 1、以某一对核苷酸为中