硕士论文开题报告-精品.ppt

Thank you!! * 牦牛初乳中抗菌作用相关基因的克隆与表达 学科专业： 指导教师： 报告人： * 开题内容 一、研究意义和国内外现状 二、主要研究内容 三、研究方法 四、技术路线 五、论文特色和创新点 六、年度计划 七、经费预算 * 1、项目的研究意义与国内外研究现  状述评 哺乳动物初乳中含有大量的生物活性物质，包括多种免疫球蛋白、非抗体保护蛋白、酪蛋白源生物活性肽等。其中溶菌酶（Lysozyme）、转铁蛋白（Transferrin,Tf）等蛋白质具有明显的抗菌活性，并且是新生动物必需的营养调节物质。从牦牛幼畜疾病控制的角度考虑，在饲料中添加乳源的抗菌物质可能成为控制养殖环节中幼犊死亡的关键技术之一。 目前，已成功将人乳腺中的Lysozyme基因转入水稻，并将转基因水稻生产的米粉作为防止婴儿腹泻的营养食品。因此，通过日粮添加基因工程方法生产的Lysozyme、Tf可望解决牦牛幼犊腹泻导致死亡的问题。 * 2、本课题研究的主要思想，主要观 点，主要内容，重点和难点分析 2.1 研究的主要思想观点和目标： 克隆牦牛乳腺中的Lysozme 和Tf全基因和其cDNA序列；获得 转Lysozme 和Tf基因的E.coli基因工程菌；获得转Lysozme 和Tf基因的酵母基因工程菌。亲和层析法分离重组的Lysozme 和Tf并进行抗菌和犊牦牛的饲养实验。 * 2.2研究的主要内容 2.2.1 Lysozme 、Tf基因克隆 ① 根据黄牛的Lysozme 、Tf基因cDNA序 列设计PCR引物 ② 牦牛Lysozme、Tf基因的克隆和全长cDNA的获得和鉴定 2.2.2 Lysozme和Tf在E.coli中的异源表达 2.2.3 Lysozme和Tf在酵母中的异源表达 * 2.2.4 Lysozme 、LFc和Tf重组蛋白的分离纯化 ① 采用亲合层析法从基因工程菌中分离纯 化Lysozme和Tf ② 表达产物的分离纯化及抗菌机理研究 2.2.5 Lysozme 、Tf对犊牦牛的营养作用机理研究 ① Lysozme 、Tf对犊牦牛肠道形态学及微 生物 菌群的影响 ② Lysozme 、Tf和对犊牦牛生长性能及免疫指标 的影响 * 2.3 拟解决的关键问题:本项目中存在三个关键的技术问题 ①全长cDNA的获得 由于普通牛的Lysozme、Tf基因已经被克隆,因此可采用PCR或RT-PCR的方法获得2个基因的cDNA序列或全基因序列。为获得全长cDNA 序列我们准备采用Clontech 公司的Smart cDNA合成技术得到全长cDNA。其特点是采用了一种名为superscript Ⅱ 的逆转录酶。 * ②高效异源表达系统载体的构建 由于Lysozme 、Tf均为真核生物的基因，其蛋白上有许多修饰基团，因此在表达该蛋白时采用真核表达系统是适宜的。解决问题的方法是除用大肠杆菌的pET载体进行表达外，还将Lysozme 、Tf基因在酵母用pPICZαA载体载体进行表达。 * ③异源表达的Lysozme和Tf抑菌和抗菌效果 异源表达的Lysozme和Tf 是否具有抑菌和抗菌效果是本项目的关键之一，因此当表达产物的抑菌和抗菌活性较低或不具有抑菌和抗菌效果时，可更换不同的表达系统。 * 3、研究方法 3.1乳腺组织总DNA和mRNA的制备：采用常规方法进行。全长cDNA的合成用Clontech 公司的SMART 技术合成。Lysozme 、Tf基因序列的获得采用PCR方法，相应基因的cDNA序列通过RT-PCR方法获得。 3.2Lysozme 和Tf的cDNA采用 pET-32载体构建失控型载体在E.coli进行原核表达。 * 3.3Lysozme 、Tf的cDNA采用毕赤酵母的pPICZαA载体进行表达。 3.4Lysozme和Tf的抗菌和饲养实验按按常规方法进行。 4 技术线路和实验方案 4.1总技术路线 * 采样牦牛 * 初乳期乳腺组织 常乳期乳腺组织 分离mRNA 分离mRNA