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荧光定量PCR操作规程(组织)
附录 1
第一步：RNA的提取
材料：
灭菌过的枪头、匀浆器、EP管、去离子水；TRIzol Reagent、三氯甲烷、异丙醇、、无水乙醇、离心机。
步骤：
1）将大约100mg组织加入研磨器，加入1ml的TRLzol Rengent研磨20-30min；直到看不到大块的组织。
2）将液体倒入灭菌后的EP管内，加三氯甲烷250 μl，上下颠倒充分混匀，静置5min， 4℃离心，13000×g，10min。
3）取上清液500 μl于另一灭菌过的EP管内，加入等量的异丙醇，混匀后放入4℃的冰箱15min后取出，4℃离心，13000×g，10min；倾倒出上面的液体，留在管底的白色沉淀即为RNA。
5）加入75%的乙醇1ml，4℃离心，7500×g，5min。
6）将上面的液体倒出，只剩白色沉淀；再瞬时离心，尽量吸干管内的液体，晾干，再加入适量的去离子水加以溶解。
第二步 逆转录
准备材料：逆转录试剂盒（TOYOBO，日本）
反应体系：
5×RT Buffer 4 μl
dNTP 2 μl
Oliga(dT)20 1 μl
RNase free H2O 1μl
Rnase inhibitor 1μl
ReverTra Ace 1μl
RNA 10μl
总体系 20μl
反应条件：
42℃ 20min
95℃ 5min
4℃ 5min
第三步 Real-time PCR
材料：SYBR Green mix（TOYOBO公司，日本）、上下游引物、cDNA、ddH2O
步骤：
1、反应体系
SYBR Green mix 12.5μl
Plus solution 2.5μl
上游引物（10pmol/μl） 1μl
下游引物（10pmol/μl） 1μl
ddH2O 5.5μl
cDNA（10倍稀释） 2.5μl
总体系 25μl
2、反应条件
50℃ 2min；
95℃ 2min
95℃ 15s
退火 15s
72℃ 45s
72℃ 10min；
3. 扩增程序图：
40个循环
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