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SiRNA 实验敲除内源性E3 连接酶 1. 材料 ·孵箱（37℃，5%，10% CO ） 2 ·含0.05%胰蛋白酶（trypsin ）的EDTA ·培养液（DMEM+10%FBS ，DMEM+30%FBS ，不含 penicillin /streptomycin ） ·减血清培养基（OPTI-MEM ） ·转染试剂（Oligofectamine reagent ） ·siRNA 寡核苷酸序列 ·不含RNA 酶1.5 ml EP 安全锁管 ·Hela 细胞，U2OS 细胞 ·P60 组织培养皿 ·15 ml 聚丙烯锥形管 ·50 ml 聚丙烯锥形管 ·1×PBS （灭菌） ·EBC buffer (50 mM Tris, pH 7.5, 120 mM NaCl, 0.5% NP40) ·完全 MINI 蛋白酶体抑制剂混合片剂 ·ECL 检测试剂 ·3×蛋白染料缓冲液（6.7% SDS, 33.3%甘油, 300 mM DTT,溴酚蓝 直至变为橙色） ·蛋白定量试剂 ·BSA 稀释至1 mg/ml ·分光光度计 ·PVDF 膜 ·HRP 连接的抗体 2. 操作流程 注：下述方法为 P60 组织培养皿的操作流程，若使用6 孔板，则用 量减半。 1. 转染前一天，胰酶消化细胞并在无抗生素DMEM+10% FBS培 养液中混悬细胞。特别注意无抗生素培养液能够增强转染效率。 细胞生长达到20-25%的融合度时进行转染。例如1:00 PM接种 5 5 2.2×10 HeLa 细胞3.0 ×10 U2OS细胞，约次日9-10:00 AM 可达到此密度。 2. 转染前37℃水浴预热OPTI-MEM 培养液，转染时培养液置于 室温。 3. 各样品准备一只1.5ml 微量离心管（灭菌，除RNA 酶，只能在 组织培养箱中打开），另备一只主混合管。 4. 各样品管加入356μl OPTI-MEM 和14μl oligo，轻轻涡旋混匀。 5. 各样主混合管加入22μl 预热的 OPTI-MEM 和8μl 转染试剂。 6. 混合物置于室温10min。同时，标记各个将被转染的培养皿。 7. 取出主混合管30μl 混合物加入各样品管。勿涡旋。轻轻翻转混 合几分钟。 8. 室温孵育25min 。同时，以1 ml OPTI-MEM 清洗培养皿一次除 去血清。各60mm 培养皿加入1.6 ml OPTI-MEM。 9. 将转染混合物 400μl 滴加至各标记的培养皿。立即上下左右各 侧晃动培养皿进行混合。 10. 在37℃，10% CO 孵育4-5 h （根据起初融合度，密度较大， 2 则转染时间延长）。 11. 加入1 ml （37℃水浴）预热的30%FBS DMEM至各培养皿。 恢复至5% CO2 。 12. 48h 后收集细胞。含完全MINI 蛋白酶体抑制剂(1 tablet/10 ml EBC buffer)的EBC buffer 裂解细胞，进行Western blot 分析。 如 HeLa 细胞, 用160-180 μl EBC + PI buffer (85-100%融合 度). 如 U2OS 细胞, 用 140-160 μl. 在冷室（4 ℃）震荡裂解 物 20 min, 4 ℃ 14,000 rpm 离心10 min。将上清液转入1.5-ml Ep 管中。 13. 测定裂解产物蛋白浓度，并储存于-80℃。 14. Western blot：加样于10% SDSmini-gels，120-130 V 电泳 1-1.5 h 。在冰上用 Bio-Rad 转膜仪将分离的蛋白转至 PVDF 膜，100 V，2 h 。含5% 奶粉的TBST 封闭30-45 min 。 一抗冷室孵育过夜。TBST buffer 洗膜4 次(每次10-15 min)， HRP 连接的抗体（TBST 溶解，含5% 奶粉）室温孵育