动物组织胚胎学实验技术.ppt

动物胚胎发育观察 材料：鱼类 优点：体外受精和发育 卵膜透明 发育时间短 操作步骤：取材、固定、洗涤 将动物杀死，剪开腹腔，依次取肝、肠等，切成规则的小块或小段，用Bouin氏液固定，大约30min后，取出置于滤纸上修整。固定剂用量为材料块体积的10-15倍，一般固定12-24h，中途可更换一次固定液 倒去固定液，用70%酒精洗涤数次 操作步骤：脱水、透明、透蜡 组织块依次经过70%，80%，95%，95%，100%，100%酒精（45-60min），1/2无水酒精+1/2二甲苯（30-45min），二甲苯（15-30min） 依次经过1/2二甲苯+1/2石蜡（30min），石蜡（45-60min），石蜡（45-60min） 操作步骤 包埋 切片 展片和贴片 操作步骤：染色 将切片依次经过二甲苯（10-15min）、二甲苯（10-15min）、1/2二甲苯+1/2无水酒精（5min）、100%酒精（2-3min）、95%酒精（2-3min）、90%酒精（2-3min）、80%酒精（2-3min）、70%酒精（2-3min）、蒸馏水、苏木素（45-60min）、自来水（返蓝为止）、酸性水（数秒）、碱性水（或自来水）（返蓝为止）、蒸馏水、伊红水溶液（3-5min）、70%酒精（2-3min）、80%酒精（2-3min）、90%酒精（2-3min）、95%酒精（2-3min）、95%酒精（2-3min）、100%酒精（2-3min）、100酒精（2-3min）、1/2无水酒精+1/2二甲苯（3-5min）、二甲苯（3-5min）、二甲苯（3-5min） 操作步骤 封片 观察 组织切片的形态计量技术 自编软件 细胞长径、短径测定 细胞面积测定 教材 自编讲义 芮菊生等，1980。组织切片技术。高等教育出版社 思考题 组织学制片中，常用固定剂有哪些，主要作用是什么？ 为保证组织学材料切片的效果，在材料的固定、脱水、浸蜡等主要操作过程中应注意哪些问题？ H.E.染色后，细胞核和细胞质分别被染成什么颜色？ 谈谈如何利用现代先进的科学技术手段，使对组织学切片的检测更客观准确。 成绩评定 实行考查，期末成绩根据实验期间的出勤和上交的实验报告综合评定，该部分内容占本门课程的1/4-1/3。 动物组织胚胎学综合性实验 实验目的 了解动物的早期发育过程 掌握石蜡切片的操作方法 掌握永久装片的制作过程，为研究动物的内部结构奠定基础 将经典的石蜡切片技术与其他新的技术方法相结合，使组织学的观察研究从简单的形态结构观察和定性描述转向准确、可靠的定量分析组织切片的形态计量技术 教学内容 动物胚胎发育观察：21学时（3天） 动物组织石蜡切片技术 实验前的准备：试剂、染料等配制，玻璃器皿等清洗，石蜡熬制，3-4学时 动物组织块选取、固定、修整，3学时 组织块脱水、透明、石蜡包埋，6-7学时 组织块切片、染色、封片，6-7学时 制作好的组织学切片的观察、拍照，3-4学时 组织切片的形态计量技术，3-4学时 实验内容与方法 人工催产和授精，获得鱼类的受精卵，在解剖镜下观察胚胎发育过程，用显微数码系统拍照。 取不同发育阶段的胚胎进行固定，以作为检测其器官、系统组织学特征随发育过程而变化的材料。 石蜡切片法：是显微技术上最重要、最常用的一种方法。它是把材料封埋在石蜡里面，用旋转切片机切片，可以切出很薄的切片。 全都过程包括：固定、洗涤、脱水、透明、包埋、切片、贴片、展片、烤片、脱蜡、复水、染色、脱水、透明、封片等。 固定的目的 固定就是用药品把细胞杀死，使细胞的原生质凝固，死后不发生变化，尽可能保持原来的结构以供观察。 固定的作用 防止组织自溶和腐败 使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下来从而保存细胞的各种组成成分使其保持与生活时相近似的形态和结构 因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生不同的折光率，造成光学上的差别使原来在生活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，且有的固定剂还有助染作用(如醋酸、苦味酸)，从而使细胞各部易于染色 固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化而不易变形，有利于操作 固定剂的特点 穿透力强，使细胞立刻致死，原生质全部凝固，不发生任何变形 增强折光率，不妨碍染色 固定剂的种类：简单固定液：以一种化学药品配制的固定液 酒精即乙醇，用作固定液，常用纯酒精或95％酒精。酒精穿透力强，固定时间常在1小时以内。高浓度酒精有使材料收缩的作用。70％的酒精可作保存液。配制低度酒精必需要用普通酒精即95％的酒精，绝不可用纯酒精。酒精为还原剂，不能与铬酸、锇酸、重铬酸钾等氧化剂配合。酒精可使核酸，蛋白质及肝醣等发生沉淀，但能溶解脂肪及拟脂。 福尔马林即甲醛，具强烈刺激性的气味，纯净的甲醛，为无色透明液体。固定用的浓度为4-