RealtimePCR检测原理和问题处理概要.ppt

荧光PCR区别于其他PCR方法主要有以下优点 1) 全封闭反应，无需PCR后处理 2) 特异性强，灵敏度高 3) 采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确 4) 定量范围宽，可达到10个数量级 5) 仪器在线式实时监测，结果直观，避免人为判断 6) 可实现一管双检或多检7) 操作安全，缩短时间，提高效率 8) 利于自动化和联网管理 定量PCR常见问题处理 扩增曲线-Amplification Plot 标准曲线-Standard Curve 原始数据-Component 各波长的原始信号-Spectra 融解曲线-Dissociation 定量PCR实验中的10个常见缺陷 1.引物或探针的设计不过关 2.RNA模板质量差 3.没有使用“预混液”，导致差异的累积 4.发生污染 5.没有使用无逆转录酶的阴性对照，排除基因组DNA的干扰 6.选取了不恰当的“内参基因” 7.在使用SYBR Green染料的实验中，没有引入“融解曲线分析” 8.没有正确设置“基线”和“阈值线” 9.反应体系“扩增效率”低下 10.标准曲线的范围没有涵盖样品量的变化 导致异常实验数据的常见原因 错误的荧光染料设置 错误的反应程序设置 荧光污染 反应试剂质量问题 仪器硬件问题 未正确密封而导致的试剂蒸发 实例1：没有标准曲线 标准品没有填写相应的数值 实例2：没有扩增曲线 原因1：PCR参数设置错误 ?数据收集步骤只有一个循环，只收集了一个数据点。 实例2：没有扩增曲线 原因2：硬盘休眠，数据采集中断 实例3：基线下滑 从原始数据找原因 ?1-9循环，ROX的信号下降 ?基线设定4-13范围内，ROX信号值变化，FAM的信号值基本固定；FAM/ROX的校正后，基线不是水平的直线； ?应该取ROX信号稳定的10-20循环为合理的基线范围。 实例3：基线下滑 修改基线范围为10-20，重新分析 实例3：基线下滑 基线范围取10-20循环的数据，重新分析后的图谱 实例4：扩增曲线弯曲 原因：基线设置的终点大于样品CT值。通常是因为模板DNA浓度过高，若CT值 15，而基线范围仍然取3-15其中基线荧光包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值设定过高。 解决方案：减小基线终点设置至最小CT值前4个循环，重新分析数据。 实例4：扩增曲线弯曲 原因：样品浓度跨度太大，有的样品浓度太高，在同一基线设置情况下，会导致Ct值太小（小于基线右侧）的样品的曲线在右侧下跌。 解决方案：对于能检测出Ct的样品，读出数据；浓度太高的样品，需稀释后另做实验。 实例5-1：直线扩增曲线 部分探针降解后，部分报告荧光基团从探针上脱落 导致：基线抬高；扩增与荧光信号的增加不一致。 实例5-2：直线扩增曲线 ?扩增曲线是一根水平直线 ?说明没有检测到信号，提示实验失败 实例6：非特异性扩增 SYBR Green I 实验，Dissociation curve分析 推荐措施：提高引物设计质量，避免形成引物二聚体 补救措施：优化引物浓度和退火温度，专设高温度的收集信号步骤 实例7：重复性不佳 正常的原始数据 实例7：重复性不佳 不正常的原始数据 原因：盖子未盖紧，溶液蒸发。 疾病监测中常用的反应Mix ABI公司 AgPath-IDOne Step RT-PCR Kit（货号 AM1005） Invitrogen 公司 SuperScript? III Platinum? One-Step qRT-PCR Kit w/ROX （货号11745-100） QIAGEN公司 QuantiTect Probe RT-PCR Kit （货号204443） Thanks for your attention * Real-time PCR检测技术原理和问题处理 2014-06-25 　　 ? ★实时荧光定量PCR检测技术（Real-time PCR) 荧光定量PCR（Realtime fluores-cence quantitative PCR,RTFQ PCR)是1996年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量实验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。 ★实时荧光定量PCR检测技术（Real-time PCR) 定量PCR的数学原理 定量PCR的化学原理 定量PCR的光学原理 什么是PCR？ PCR的反应过程 RT-PCR原理图 荧光定量PCR的数学原理 1、Baseline (基线) 2、Threshold (阈值