肿瘤细胞生物学1-2.ppt

(2) BrdU检测法 BrdU中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期）掺入。然后通过BrdU含量的检测，定性、定量的反映细胞增殖状态。 BrdU检测法结果 BrdU标记连续培养的家兔脂肪组织来源干细胞（荧光免疫组化） A：ADSCs 的接种情况（倒置相差显微镜× 100）；B 阴性对照；C、D、E、F： BrdU 分别加入12 h、24 h、48 h、72 h（荧光显微镜× 100） A B C D E F BrdU标记连续培养的家兔脂肪组织来源干细胞（FACS检测） EdU ：5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷，一种胸腺嘧啶核苷类似物，其乙炔基团在天然化合物中很少见。作用与BrdU类似。 BrdU法的改进——Cell-Light? EdU 核酸标记技术 Cell-Light ?细胞增殖检测方法基于EdU与Apollo?荧光染料的完美结合检测新合成DNA，简单，快速，准确。 Cell-Light? EdU 与 BrdU 检测结果比较 BrdU需要DNA变性后才能与抗体结合，导致BrdU、Hoechst染色弥散，边缘模糊不清；而EdU边缘清晰完整，检测更灵敏、更准确； Apollo染料分子很小，能够轻松地透过膜结构，无需DNA变性即可与EdU特异性结合发光，而且不会影响其与其他染料的结合，能够准确定量DNA总量。 在细胞水平上的多重联合检测 在组织水平上EdU对增殖细胞的标记（小鼠小肠组织） EdU标记干细胞进行示踪实验 EdU标记ADSC（家兔脂肪组织来源干细胞）细胞移植情况（红色：EdU；蓝色：DAPI；绿色：α-SMA抗体）；示踪标记时间长达6周，远胜于BrdU； BrdU 与EdU 检测优缺点综合比较 1. 形态学检测 4. 细胞凋亡的常用研究方法 细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 Hoechst33342染色 PI和Hoechst33342双标 （confocal） PI（碘化丙啶）不能通过正常的细胞膜， PI着红色为坏死细胞； Hoechst则为膜通透性的荧光染料，正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而凋亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。 2. 分子生物学检测 Caspase-3活性的检测 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（PS)外翻示意图 显微镜观察 左图：早期凋亡的胸腺细胞Annexin V阳性、PI阴性；中图和右图：相对晚期凋亡阶段：胸腺细胞Annexin V和PI双阳性 (由于细胞膜受损，细胞核被PI染色)。Annexin V标记的小泡在细胞表面很明显。 经Etoposide处理过的胸腺细胞：以FITC标记的Annexin V 和PI进行体外活体双染色。 荧光显微镜观察 正常细胞:JC-1染料在线粒体内形成多聚体，发红色荧光； 凋亡细胞:由于线粒体膜电位的破坏， JC-1染料不能聚集到线粒体内，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。 线粒体膜势能的检测 DNA片断化检测 细胞凋亡：特征性的梯状条带(DNA ladders)，其大小为180-200bp的整数倍； 细胞坏死：DNA随意断裂为长度不一的片段，呈“弥散状”(smear ladders)条带 典型凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳（呈现梯状条带） TUNEL法 TUNEL原理示意图 方法 荧光标记法 FITC标记的组织TUNEL检测 其他分子的检测 Bcl-2 作为抗凋亡的调节物，其表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。 Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞（cytotoxic T cells）等靶细胞。 通过检测fas, bcl-2等基因的蛋白质和mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。 5. 细胞浸润及迁移的检测 1. 伤口愈合试验法 2. Boyden chamber实验 - trans-well 小室实验 Transwell的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子。 Transwell装置的纵切面 肿瘤细胞迁移实验 常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。 肿瘤细胞浸润实验 常用8.0、12.0μm膜，原理