[理学]18 原位杂交技术.ppt

核酸分子杂交 -----原位杂交;原位杂交的地位; 在一定的条件下，应用标记抗体（抗原）与组织切片或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应。如果组织或细胞中含有相应抗原（抗体），二者结合形成抗原抗体复合物，其中所带的标记物如酶或荧光素遇到底物或激发光时产生显色反应，在显微镜（包括普通光镜、荧光显微镜和电子显微镜）下，就可以原位确定组织中或细胞内抗原的分布位置和性质；经图像分析也可达到定量的目的。 ;基本内容;一、原位杂交的基本原理;一、原位杂交的基本原理;根据分析检测对象的不同，分为：菌落原位杂交、组织原位杂交和基因组原位杂交。 1、菌落原位杂交： 将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂解以释出DNA或RNA。将DNA或RNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。 ;2、组织原位杂交： 用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。 ;3、基因组原位杂交： 基于核酸分子杂交的基本原理，用标记的核酸探针，经过检测系统，对染色体和染色体组整体进行分析检测的一种手段。 ;1、地高辛原位杂交 2、荧光原位杂交（FISH） 3、多色荧光原位杂交 4、比较基因组原位杂交 5、RNA原位杂交;三、发展起的新技术;1、地高辛原位杂交 优点： *对人体无害 *不受半衰期时间的限制，探针可以长期保存 *不受组织、细胞中内源性生物素的干扰 *分辨率和敏感性与同位素标记探针不相上下 *染色鲜艳、反差好 *成本低;三、发展起的新技术;三、发展起的新技术;2、荧光原位杂交(FISH) 优点： *安全、快速、灵敏度高 *探针能长期保存 *能同时显示多种颜色 *不但能显示中期分裂相，还能显示间期核 *与局限于活细胞、灵敏度相对较低的传统细胞遗传学技术相比，FISH应用范围广、灵敏度高、可以检出较小片段的变异，能更好地满足临床常规诊断的需求。 ;3、多色荧光原位杂交 利用FISH可以对不同的靶DNA进行同一标本上的定位，但是不同荧光分子的光谱存在重叠，限制了对不同颜色荧光分子的应用。 为了克服这一缺憾，利用比例标记法，使FISH技术从单色发展到多色水平，同一个探针可以同时利用几种不同颜色的荧光分子进行标记组合以产生新的颜色，通过调整各种荧光分子之间的比例来扩展探针标记的容量。;三、发展起的新技术;通过整条染色体涂染判断易位染色体;4、比较基因组原位杂交(CGH ) 利用两种不同的荧光分別标记两种不同細胞的Genomic DNA，再同时与正常的染色体进行杂交，染色体上不同荧光间的强弱对比不同，由此比较而观察基因组中特定基因的拷贝数变化。 CGH主要用于检测肿瘤组织DNA拷贝数变化（缺失、复制、扩增），并能将这些异常在染色体上定位。该方法通过同一次实验即可扫描整个肿瘤基因组DNA序列的增加或丢失。;5、RNA原位杂交 用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。;四、原位杂交技术的特点;1、能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 2、不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度?? 3、能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态 ;四、原位杂交技术的特点;1、菌落原位杂交;1、菌落原位杂交;①将硝酸纤维素滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上，用无菌牙签挑取单菌落种于滤膜和主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相同。 ②培养细菌至产生1-2mm大小的菌落。 ③在一块平皿中置4张滤纸，用10%SDS浸透，倒掉多余液体，将带有菌落的滤膜取下轻轻置于滤纸上，菌落面在上，注意防止滤膜底面存有气泡。 ;④5min后，将滤膜转至用变性溶液（0.5mol/L?NaOH,1.5mol/LNaCl）浸湿的滤纸上，放置10min。 ⑤将滤膜转至中和溶液（1.5mol/L?NaCl,?0.5mol/L?Tris-HCl?pH8.0)浸湿的滤纸上，放置10min，重复中和一次。 ⑥将滤膜移至用2×SSPE溶液浸过的滤纸上，放置10min，SSPE配成20×贮备液：3.6mol/L?NaCl,0.2mol/L?NaH2PO4(pH7.4)，20mmol/L?EDTANa2（pH7.4)。 ⑦将滤膜用滤纸吸干，80℃真空烘干2h。  ;五、原位杂交的主要步骤;1.制片 染色体原位杂交要求高质量的细胞学制片，因而需要最好的细胞分裂相。 细胞分裂相应