[理学]7 分子生物学研究法上 —DNA、RNA及蛋白质操作技术.ppt

此外，还有很多大容量克隆载体，如柯斯质粒、细菌人工染色体（BAC）、P1源人工染色体（PAC）、酵母人工染色体（YAC）等都可用于基因组文库的构建。 它们的优点是可以插入更大片段DNA，但是稳定性一般较差，在大量复制的过程中容易出现缺失现象。操作也相对较困难。 该法仅适用于对表达文库的筛选。若实验中靶基因的序列完全未知但是有针对该基因产物的特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。 6. SNP的理论与应用 SNP是Single Nucleotide Polymorphism的缩写，即单核苷酸多态性，是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A，T，C和G）的突变而引起的多态性。 SNP概述 科学上把染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点。SNP是基因组中最简单最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性。SNP检测和分析技术已经成为继限制性片段长度多态性（RFLP）和微卫星标记（SSR）之后的第三代遗传标记。 据估计，人类DNA中每300-1000个碱基对就有一个SNP，因此，一个人类个体大约携带300万-1000万个SNPs。位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单倍型（haplotype），相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代。 根据SNP在基因组中的分布位置分为编码区SNP（cSNP），调控区SNP（pSNP）和非编码区SNP（rSNP）三类。编码区内的变异率仅占周围序列的1/5，cSNP的总量显著少于其它两类SNPs。cSNP分为同义cSNP（synonymous cSNP，即编码序列的改变不影响所翻译的氨基酸序列）和非同义cSNP（non-synonymous cSNP，即碱基序列的改变使氨基酸序列发生改变，可能影响蛋白质的功能）。 SNP的检测技术 通过DNA测序法获得新的SNP。 基因分型（genotyping）是指利用数据库中已有的SNP进行特定人群的序列和发生频率的研究，主要包括基因芯片技术、Taqman技术、分子信标（molecularbeacons）技术和焦磷酸测序法（pyrosequencing）等。 1）基因芯片技术 通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互补的序列杂交而不与含有单个错配碱基的序列杂交。 优点：高通量，一次可对多个SNP进行规模性筛选，被检起始材料也很少，操作步骤简单。 缺点：芯片设计成本高。而且，由于DNA样品的复杂性，有些SNP不能被检测。 2）Taqman技术 PCR反应系统中加入2种不同荧光标记的探针，分别与两个等位基因配对。随着PCR的进行，与模板完全配对的探针逐步被TaqDNA聚合酶的5’→3’外切活性所切割，荧光基团与3’端的淬灭基团分离，荧光基团被激活。不完全配对的探针（代表另一种等位基因）不能被有效切割，供体荧光基团依然被淬灭。 3）分子信标（molecular beacon）技术 是一种呈茎环结构的荧光标记的寡核苷酸，环状区与靶序列特异性结合，茎干区由5-8个碱基对组成，5’端带有荧光发生基团，3’端带有荧光淬灭基团。自由状态时，分子信标呈发卡式结构，荧光几乎完全淬灭。与靶分子相结合时，荧光基团和淬灭基团之间的距离增大，分子信标的荧光恢复。 20 μg total proteins extracted from Arabidopsislines and 10 μg extracted from E. coli before (–) and after (+) IPTG-induction. OEL, sample prepared from BARD1over-expressing line. Han, P., Li, Q. and Zhu, Y. X. Mutation of Arabidopsis BARD1 causes meristem defects by failing to confine WUSCHEL expression to the organizing center. Plant Cell 20 (2008), 1482-1493. * * 3. 蛋白质质谱分析技术 蛋白质组学中最有意义的突破是用生物质谱鉴定电泳后分离的蛋白质。该技术是一种超灵敏的技术，从理论上说，仅需少量样品就可获得误率低于百万分之一的结果。 THANK YOU ! 图5-18噬菌体表达文库的免疫化学筛选法示意图 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 酶 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 无色的底物 有色的产物 观察 酶 19 图5-19 染色体上共同遗传的SNP组合。图中SNP1和SNP2在同一条染色体上而且距离很近，SNP1有等位位点